使用长读长测序技术进行扩增子测序

我研究便携式长读长测序技术是否能够在资源有限的环境中提供与金标准方法准确性相当的结核病耐药性检测结果，从而推动可及性强、高质量的结核病诊断。通过靶向高通量测序作为耐药结核病的诊断工具，直接从临床样本获得全面的耐药谱，且无需生物信息学专业知识。我们的长读长测序方案有望实现比实时耐药检测更快的周转时间、更简化的操作流程，有助于在基础设施有限的资源匮乏地区开展全面的结核病诊断，并加强疫情暴发的追踪能力。

首先，根据浓度计算每个扩增子样品的100纳克所需体积，并将相应体积转移至洁净的PCR管中。使用给定公式计算样品中扩增子的总质量。用无核酸酶水将每个样品的总体积调整至12.5微升。

用移液器轻轻吹打样本10次以混匀，并在微量离心机中短暂离心。随后，向每个样本中加入1.75 µL末端修复和腺苷化反应缓冲液，再加入0.75 µL末端修复和腺苷化酶混合液。混匀并离心后，将离心管置于热循环仪中，25 °C反应30分钟，随后65 °C反应30分钟。

进行原生条形码连接时，在新的PCR管中加入屏幕上显示的组分。用移液器轻轻混匀反应体系，并使用微量离心机短暂离心。接着，向每根试管中加入一微升EDTA。

然后，充分混匀，并像之前所示那样短暂离心。将条形码样本吸入一个1.5毫升的微量离心管中。涡旋DNA纯化磁珠以彻底重悬，加入体积等于混合样本总体积0.7倍的磁珠悬液。

将珠子样品溶液混合，并在室温下于HulaMixer上孵育10分钟。接下来，配制2毫升80%乙醇，将1,600微升纯乙醇与400微升无核酸酶水混合。将离心管置于磁力架上5分钟，直至流出液呈现澄清无色。

然后，小心移除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。用700 µL新配制的80%乙醇洗涤磁珠，并短暂离心。将离心管置于磁力架上后，去除残留的乙醇。

现在，将离心管从磁力架上取下。通过轻轻弹动离心管，用 35 µL 无核酸酶的水重悬磁珠，并在 37 °C 下孵育 10 分钟。然后将离心管放回磁力架，直至洗脱液变得澄清无色。

然后，将 35 µL 洗脱液转移至一个新的 1.5 mL 微离心管中，以供后续使用。进行接头连接时，将指定组分加入一个 1.5 mL 低吸附微离心管中并混匀。短暂离心后，在室温下孵育 20 分钟。

涡旋振荡DNA纯化磁珠，使其完全重悬。向离心管中加入20 µL磁珠，并轻轻混匀。在室温下，将样品置于HulaMixer上孵育10分钟。

然后，将离心管置于磁力架上，使磁珠形成沉淀，吸除上清液时注意不要扰动沉淀。加入125微升短片段缓冲液，轻轻弹动离心管以重新悬浮磁珠。短暂离心后，再将离心管放回磁力架上。

当磁珠沉淀后，再次吸去上清液。随后将离心管从磁力架上取下，用移液枪轻轻吹打或轻弹管壁，以15 µL洗脱缓冲液重悬磁珠。短暂离心以收集管内液体，然后在37 °C孵育10分钟，以洗脱DNA。

将离心管置于磁力架上，直至洗脱液澄清无色。然后吸取15 µL洗脱液，转移至一支洁净的1.5 mL微量离心管中。为制备流动池预润溶液，请充分混匀所提供的各组分。

打开流动池的预润洗孔，吸取约20微升缓冲液以去除气泡，并将800微升预润洗混合液加入该孔中，注意避免引入气泡。为制备DNA文库，请充分混匀屏幕上显示的各组分。轻轻抬起流动池的样品加样孔盖，将200微升预润洗混合液加入预润洗孔中，注意避免引入气泡。

将制备好的DNA文库混合后，将75微升文库溶液逐滴加入测序芯片的样品孔中。关闭芯片样品孔盖，确保塞子牢固地插入样品孔，然后紧密关闭引物孔。凝胶电泳证实几乎所有样本的扩增子完整性良好，但对应于样本89和136的泳道显示出微弱或无条带。

样本89和136的扩增子浓度不足，因此被排除在长读长测序之外。在所有靶向基因中，长读长和短读长平台均实现了较高的覆盖深度，其中EIS基因的平均值最高，而RRS基因的覆盖深度最低。尽管覆盖深度存在差异，但两个平台在所有耐药相关基因上的覆盖广度均保持在99.9%。

在短读长和长读长测序平台之间，乙胺丁醇、氟喹诺酮类、卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素的耐药变异检测一致性达到100%。使用任一种测序方法均未发现与利奈唑胺、贝达喹啉和氯法齐明相关的耐药突变。链霉素耐药检测在不同平台间的一致性较低，仅达到71.43%的一致性。

在不同平台之间，对关键基因 rpoB、katG/fabG1/ahpC/inhA、fabG1/inhA 和 pncA 的检测灵敏度范围为 89.47% 至 96.77%。