基于转录组学的低成本药物筛选

转录组学使我们能够深入理解细胞程序及其对外部变化的响应。然而，尽管在过去几十年中，文库构建和测序成本已显著降低，但要将该技术应用于药物筛选所需的规模时，其成本仍然过高，限制了这些方法的巨大潜力。本研究提出了一种基于转录组的低成本药物筛选系统。

将微型化扰动培养与微型转录组学相结合。优化后的微型转录组学方案可在经济有效的测序深度下提供具有信息量的生物学信号，从而实现对已知药物和新分子的大规模筛选。将转录组学与无偏倚药物筛选相结合的主要优势之一，在于有望发现此前未被考虑的新型药物靶点。

传统的药物筛选方法通常集中于已知的靶分子或信号通路，这会阻碍新靶点的发现，并可能导致药物出现意料之外的副作用以及疗效受限。首先，将PBMC冻存管置于37摄氏度水浴中解冻两到三分钟，期间轻轻翻转。然后，将解冻后的细胞转移至一个50毫升的锥形管中。

用一毫升温热的完全培养基冲洗冻存管，并将溶液逐滴加入锥形管中的细胞，以完成第一次稀释步骤。随后，将细胞悬液以5分钟离心，流畅地倾倒锥形管以去除上清液。用三毫升温热的完全培养基重悬细胞。

进行细胞计数时，取10微升细胞悬液与台盼蓝混合。使用10微升染色后的细胞溶液，通过自动细胞计数仪或细胞计数板进行细胞计数。用预热的完全培养基稀释细胞，使其最终浓度达到每毫升1 × 10⁶个细胞。

然后将100 µL细胞悬液接种至96孔细胞培养板的每孔中。向每孔加入100 µL的两倍药物稀释液。收集细胞时，将细胞培养板离心10分钟。

使用真空泵吸取上清液，同时将泵的吸头置于孔的底部角落，以保留细胞。随后向每孔加入 200 µL 冰冷的 PBS。将培养板离心 5 分钟后，弃去上清液。

然后向每个孔中加入 15 µL 裂解缓冲液。使用粘性密封膜密封板以防止污染。涡旋振荡板子并离心 1 分钟。

最后，用PCR板收集六微升裂解后的细胞溶液。首先，通过离心收集经药物处理的外周血单个核细胞（PBMCs），并将细胞裂解液收集至PCR板中。离心PCR板，使裂解液聚集于管底。

接下来，使用热循环仪进行 mRNA 变性。然后向每个孔中加入 6 µL 逆转录酶反应混合液，使总体积达到 12 µL。密封反应板以防止污染和蒸发。

短暂涡旋振荡后，将板放入离心机离心。将板置于热循环仪上，并启动逆转录反应程序。逆转录完成后，对PCR板进行离心，向每个孔中加入15 µL预扩增混合液，并密封。

将密封的反应板放入热循环仪中，开始预扩增反应。为纯化cDNA，在每个孔中加入磁性纯化 beads，并在室温下孵育五分钟。将PCR板置于磁力架上五分钟，或直至磁珠完全分离。

随后，小心移除上清液。保持微孔板置于磁力架上，轻轻加入 100 µL 新鲜配制的 80% 乙醇以清洗磁珠。孵育 30 秒后，用移液器吸除上清液。

将磁力架上的磁珠静置晾干5分钟，或直至乙醇完全挥发且磁珠不再呈现光泽。从磁力架上取下反应板后，用20微升无核酸酶的水重悬磁珠。将反应板再次放回磁力架上，直至磁珠完全分离。

将洗脱液转移至预先准备好的用于cDNA质量控制和片段化处理的新PCR板中。进行片段化处理时，为每个反应在新的PCR板中加入三微升片段化反应混合液。每个反应中加入一微升cDNA。

立即开始片段化反应。然后通过向每个反应中加入一微升中和片段化缓冲液来中和反应。对于扩增PCR，向每个反应中加入九微升扩增PCR混合液，使总体积达到14微升。

启动富集PCR程序。首先，将带有独特索引的文库以等摩尔比例混合。使用高灵敏度检测方法测定最终文库池的浓度，并利用以下公式计算样品的摩尔浓度。

现在，根据仪器的规格和任何实验优化要求，加载流动池。在屏幕上选择“测序”以开始运行设置。按照屏幕提示，依次加载流动池、合成试剂盒、簇生成试剂盒和缓冲液试剂盒。

当设备识别所有试剂后，在运行设置中添加运行名称。指定测序参数为双端测序，两端读长均为51个碱基对。此外，对两个索引序列进行测序，每个索引读长为8个碱基对。

确定用于数据存储的输出目录，然后点击“审查”。在确认所有测序参数正确无误后，选择“开始运行”以启动测序。