优化的蛋白质分析方法 非洲爪蟾 通过免疫印迹法分析卵母细胞和胚胎

在动物的一生中，硫酸盐相关调控持续发生，以维持正常的发育以及成年个体的健康。这些调控依赖于一类被称为硫酸盐调节因子的特定蛋白质。本研究的目标是揭示控制这些关键调节因子合成的分子机制。

除了提供免疫印迹以及非洲爪蟾卵母细胞和胚胎的详细操作流程外，本方案还深入探讨了该模式生物常见的挑战，例如抗体的获取。通过对 Bicaudal C 的结合与抑制机制进行深入研究，我们的工作为比较其他翻译调控因子建立了重要的信息基础。开始进行免疫印迹的细胞处理时，每枚胚胎或卵母细胞加入 10 微升预冷的细胞裂解缓冲液，该缓冲液需用双蒸水稀释至一倍浓度。

使用微型研杵在冰上匀浆样品。将离心管放入台式离心机中，在4°C条件下以5,000 g离心10分钟，使包括卵黄和不溶性色素在内的碎片沉淀。转移上清液至一个新的1.5毫升离心管中，确保转移过程中不扰动沉淀物。

向收集的上清液中加入等体积的两倍浓度Laemmli上样缓冲液（含5%体积比的2-巯基乙醇）。将混合物在95至100摄氏度加热10分钟，以使蛋白质变性。随后，从包装中取出一块4至12%的Bis-Tris SDS预制胶，并撕去凝胶底部的贴纸。

将凝胶插入电极组件中，使其与缓冲液坝相对，并将整个组件放入垂直电泳槽中。然后，向电极组件和电泳槽底部加入Tris-MOPS-SDS电泳缓冲液。轻轻取出凝胶梳子，并用移液器将运行缓冲液加入加样孔中，以去除气泡并平衡缓冲液。

现在，将5 µL预染蛋白质标准品加入第一孔中，其余各孔中分别加入10 µL已制备好的样品。盖上电泳槽盖，并将其连接至电源。然后，将电压设为200伏以开始电泳。

当样品缓冲液染料前沿离开凝胶后，停止电泳。在电泳结束前，开始在转移夹中组装转膜“三明治”结构。将一个玻璃烤盘中装入预冷的转移缓冲液，并在组装过程中将所有转膜材料浸没于该缓冲液中。

将转移夹放入培养皿中，黑色半侧紧贴底部，白色半侧朝上，夹子开口朝左。将一至两片纤维海绵平铺在转移夹的黑色半侧上。将两张0.35毫米厚的纤维素层析滤纸裁剪至合适尺寸后，取其中一张置于海绵上方。

电泳完成后，从电泳槽中取出凝胶。使用凝胶夹板开启杠杆，小心地将两块凝胶板分开，同时确保凝胶仍附着在其中一侧。使用凝胶释放工具切去凝胶顶部的加样孔部分。

将凝胶（仍附着在塑料夹的一半上）放置在滤纸上，取下夹子的另一半，使凝胶平整地留在滤纸上。接着，裁剪一块0.45微米的硝酸纤维素膜，使其尺寸与凝胶相同。从保护纸上取下膜，用转移缓冲液短暂润湿，然后小心地将其放置在凝胶上方。

然后，在硝酸纤维素膜上方再放置一张滤纸。用滚轴轻轻但用力地滚压，以完全排除所有气泡。在滤纸上方再叠加一至两块纤维海绵，以完成夹心结构。

关闭转膜夹心盒，并用夹子紧密夹紧以密封组装好的夹心结构。然后，将封闭的转膜夹心插入转移核心中，夹子朝上放置，并确保夹子的黑色面与核心的黑色面对齐。将转移核心放入电泳槽中。

向槽中加入冰袋和搅拌子，确保搅拌子可自由旋转。用预冷的转移缓冲液注满槽，使装置完全浸没，并盖紧盖子。将装置连接至电源，对准电极颜色，设置条件为100伏特，搅拌子保持旋转，电泳1小时。

转移完成后，小心打开夹板并拆开“三明治”结构。取出硝酸纤维素膜，并标记与凝胶接触的一侧。然后将硝酸纤维素膜放入一个小容器中，使其平整地贴附在容器底部。

用丽春红染液完全覆盖膜，置于摇床中轻轻摇动染色5至10分钟。倒出丽春红染液后，用双蒸水反复漂洗膜数次，直至去除多余的染料，蛋白条带在泳道中清晰可见。随后，按图示进行膜封闭、抗体孵育及洗涤步骤。

二抗孵育和洗涤完成后，即可对膜进行成像。在暗室中打开胶片显影仪并预热。裁剪两张足够大的塑料膜，能够完全覆盖膜。

用镊子将硝酸纤维素膜正面朝上放置在第一张塑料膜上。在1.5毫升离心管中，等体积混合增强型化学发光鲁米诺试剂和增强剂试剂。然后，取约1毫升该混合液覆盖大多数膜。

用塑料膜轻轻操作膜，确保整个表面均匀覆盖，并孵育一分钟。然后用镊子夹住膜，轻轻抖动以去除多余的 ECL 试剂。将膜正面朝上放置在第二张塑料膜上，将塑料膜 loosely 折叠覆盖在膜上，并用胶带将膜牢固地固定在自显影胶片盒中。

接下来，按照所示步骤在暗室中使用放射自显影胶片对膜进行成像。当获得理想的蛋白显影结果后，将显影后的胶片与发光标记物对齐，并以此为参照，在胶片上标记出预染蛋白标准品的位置。成像完成后，小心地将膜从保鲜膜上取下，浸入TBSTW中，以洗去残留的ECL试剂。

膜的丽春红染色证实了蛋白质转膜成功。在卵母细胞样品中未检测到内源性B1蛋白，但在约107千道尔顿处清晰检测到七期和10.5期胚胎样品中的内源性B1蛋白。使用Bicc1抗体在所有时期的注射样品中均检测到一条较小的70千道尔顿蛋白条带，表明HA-Bicc1 C端融合蛋白成功表达。

HA 抗体仅在注射的样品中检测到相同的 70 千道尔顿条带，证实了 Bicc1 抗体对融合蛋白的特异性。使用 CNOT1 抗体在所有样品中均检测到两条高分子量条带，大小分别约为 250 和 270 千道尔顿。所有样品中均检测到 54 千道尔顿 DDX6 蛋白的表达，但在 10.5 阶段胚胎中明显减少。