一种用于从冷冻保存的马精液中分离体细胞作为克隆核供体的简易微吸管技术
2025年12月19日
本方案介绍了一种简单的微吸法技术，用于从冷冻保存的马精液中分离具有活力的体细胞（SCs）。与传统方法不同，该技术避免了长时间 体外 培养并克服精子污染，可立即用于体细胞克隆。
我们的目标是证明，从冷冻保存的马精液中获得的体细胞可用于恢复具有高遗传价值的个体。目前面临的挑战是能够筛选出具有完整二倍体DNA的体细胞，用作核供体。首先，从液氮罐中取出马精液细管。
将它们暴露在空气中10秒，并在37摄氏度的水浴中解冻30秒。取250 µL解冻后的精液样本，用1 mL添加了补充物的DMEM-F12培养基进行稀释。
将精液混合物在37摄氏度下孵育30分钟。从孵育后的稀释液中移取25微升至一试管中，并加入975微升含0.1毫克/毫升聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的DPBS进行稀释。轻轻混匀悬浮液。
在整个细胞收集过程中，将稀释后的精液混合物保持在37摄氏度。将含有稀释马精液的培养皿盖置于显微镜载物台上，以准备体细胞收集。选择适合直径的微量移液管用于体细胞收集，并将其连接至机械抽吸系统。
小心地将微量移液器插入微滴中，并与培养皿盖底部对齐。一旦移液器吸入培养基，即开始单个捕获体细胞。聚焦于微滴底部，此处可见多种细胞形态。
将微量移液器吸头置于每个体细胞旁边，在负压下进行吸取。收集所有圆形和拉长的细胞，无论其大小。收集10个细胞后，将其沉积到培养皿盖上表面的10微升微滴中。
在整个收集过程中，将所有收集到的体细胞保留在该微滴内。当收集到所需数量的体细胞后，使用微滴进行简单的洗涤操作，以去除精子、碎片及微生物污染物。使用第二个培养皿盖，对体细胞进行连续的三步洗涤。
使用微量移液器将体细胞转移至第一滴液滴中，静置3到5分钟。采用相同操作，将细胞从第一滴转移至第二滴。重复转移一次，将体细胞放入第三滴液滴中。
最后，将分离得到的体细胞移入已准备好的微滴中，用于体细胞核移植。微吸管技术成功地从冷冻保存的马精液中回收了体细胞，在三匹种马中，每小时捕获细胞数介于317.7至424.7个之间，其中3号种马的回收效率最高。
根据大小和形态，鉴定出五种不同的体细胞类型。我们鉴定出一种在冷冻保存的马精子中形态和活力均不同的体细胞群体，该细胞可能可用作核供体。可根据其形态特征筛选这些细胞，且该操作无需建立原代培养。
我们将重点提高马精液浓缩后这些细胞的存活率。
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概述
本方案介绍了一种微吸技术，用于从冷冻保存的马精液中分离出有活力的体细胞。该方法避免了长时间的体外培养和精子污染，可立即用于体细胞克隆。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 体细胞可从冷冻保存的马精液中获得。
- 存活体细胞的分离对于克隆至关重要。
- 传统方法通常需要较长的培养时间。
- 精子污染可能阻碍克隆过程。
研究目的
- 演示一种从马精液中分离体细胞的技术。
- 使这些细胞可用于克隆具有高遗传价值的个体。
- 确保所选体细胞具有完整的二倍体DNA。
使用方法
- 从液氮中解冻马精液细管。
- 使用37摄氏度水浴进行解冻。
- 用添加补充物的DMEM-F12培养基对解冻后的精液进行取样和稀释。
- 采用微吸法进行细胞分离。
主要结果
- 成功分离出有活力的体细胞。
- 降低过程中精子污染的风险。
- 分离后的细胞可立即用于克隆。
- 所选细胞中二倍体DNA完整性的保持。
结论
- 微吸管技术对体细胞分离有效。
- 该方法可提高马科动物体细胞克隆的潜力。
- 未来应用可能促进马科动物育种中遗传资源的更好恢复。
常见问题
行业重要性概述
从冷冻保存的马精液中高效回收有活力的体细胞，解决了先进生殖技术在遗传资源利用中的一个关键瓶颈。该微吸管技术可直接获取二倍体供体细胞用于体细胞核移植（SCNT），避免了长期培养过程，并减少了精子污染的风险。该方法拓展了动物生物技术流程中遗传资源抢救和遗传组合多样化的潜力。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够直接检测冻存样品中体细胞的存活率和二倍体状态。
- 支持对体细胞核移植（SCNT）工作流程中核供体适用性的功能验证。
- 通过允许对供体细胞进行形态学筛选，有助于实现机制层面的风险降低。
筛选与检测方法开发
- 提供一种快速、可重复的体细胞分离方法，避免精子干扰。
- 无需建立原代培养，即可获得标准化的细胞群体，用于下游克隆实验。
- 可对细胞得率和形态进行定量评估，以优化实验流程。
转化与临床前研究
- 改善从遗传资源保藏到临床前克隆应用的连续性。
- 通过从存档材料中恢复高价值基因型，支持转化研究目标。
- 在胚胎生成前确保供体细胞的完整性，从而降低生物学风险。
流程与工作流整合
这种微吸管法在遗传资源回收与基于体细胞核移植的克隆技术之间实现了整合，将冷冻保存库与即时的核供体准备过程连接起来。
- 发现生物学：支持基于冷冻保存样本的供体细胞活力和遗传完整性的假设验证。
- 筛选：标准化体细胞分离流程，以获得可重复的体细胞核移植输入材料。
- 分析：实现对细胞得率和形态多样性的定量测量。
- 转化研究：将生物样本库保存的精液与可操作的克隆工作流程相连接，用于遗传拯救。
- 企业级复用：建立适用于不同遗传背景和存档样本的可重复使用实验方案。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对供体细胞适用性的预测可信度，并减少体细胞核移植（SCNT）中的机制模糊性。
- 操作价值：简化细胞分离流程，增强可重复性，并消除漫长的培养步骤。
- 战略价值：实现对遗传资源恢复项目的快速决策，优化资源配置。
- 组合影响：拓展可用于克隆的可行遗传材料范围，支持经风险调整的育种策略。
实施注意事项
- 需要具备显微操作和细胞形态学评估的专业技能。
- 需要配备机械抽吸系统和显微镜基础设施。
- 要求不同团队在细胞筛选和洗涤步骤上实现标准化操作。
- 可适用于多种精液样本，但可能需要针对不同物种或保存条件进行优化。
- 分离后细胞的活力可能有所差异，应监测其是否具备用于体细胞核移植的准备状态。
