利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外
2025年12月5日
该方案利用脂肪细胞特异性的CD63-GFP报告小鼠品系，可视化并定量脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的分泌，并展示其被前体细胞摄取的过程，揭示了脂肪组织内的一种旁分泌通路。
我们研究脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs），以明确其在脂肪组织中的作用，特别是它们如何调控成熟脂肪细胞与其前体细胞之间的相互作用。目前尚无用于研究脂肪细胞EV分泌的体内系统，且现有的纯化方案尚未完全优化。首先，采用无菌技术切除安乐死小鼠的腹股沟脂肪组织。
取一克试剂组织放入含有0.5毫升消化缓冲液的2毫升离心管中。使用无菌剪刀将组织剪切成不超过1毫米的碎片。将剪碎的组织悬浮于10毫升含有0.5毫克/毫升Liberase和50单位/毫升DNase I的消化缓冲液中。将样品置于37摄氏度的摇床中孵育。
孵育期间，轻轻翻转离心管数次。当溶液呈现浑浊且无可见组织碎片残留时，表明消化完成。为分离基质血管组分（SVF），用两倍体积的消化缓冲液稀释消化后的悬液。
轻轻倒置离心管三到四次，充分混匀。将悬液通过无菌的100微米滤膜，以去除未消化的组织，然后将滤液在4°C下以300×g离心5分钟。将沉淀物标记为SVF。
将基质血管组分置于冰上，用新鲜配制的红细胞裂解缓冲液避光孵育五分钟。加入两倍体积的洗涤缓冲液，在4°C下以400g离心五分钟。每克组织用80微升缓冲液重悬基质血管组分，并将悬液转移至新管中。
每克组织加入 20 微升非脂肪细胞前体耗竭混合液。在 2 至 8 摄氏度避光孵育 15 分钟。将样品过 LS 柱，收集流出液，其中含有谱系阴性细胞组分。
在4°C条件下，以300g离心流穿液5分钟，以获得脂肪细胞前体细胞。将250 µL分离的小鼠脂肪细胞前体细胞接种至胶原包被的八孔腔室载玻片上，孵育6小时。使用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，以保存细胞及细胞外囊泡结构用于成像。
接下来，用 PBS 清洗载玻片三次，然后使用抗荧光淬灭封片剂封片。接着，在计数脂肪细胞前体细胞后，将其悬浮并稀释活性染料，置于冰上避光孵育 20 分钟。
用洗涤缓冲液洗涤细胞一次，然后离心。将细胞重悬于 Brilliant 染色缓冲液中，使最终浓度为每 100 微升含 100 万个细胞。通过加入 Fc 受体阻断试剂（按 1:100 比例）阻断非特异性结合，并进行孵育。
将SCA-1抗体在4°C条件下以6000g离心10分钟。按1:100稀释比例将SCA-1抗体加入APC管中，然后将管子置于冰上避光保存。用1毫升洗涤缓冲液洗涤细胞两次，每次在4°C条件下以300g离心5分钟。
将细胞重悬于流式细胞术分选用洗涤缓冲液中，然后使用配备紫色和蓝色激光的光谱流式细胞仪，获取SCA-1阳性及GFP阳性细胞的数据。开始分化前，用0.2%明胶在室温下孵育30分钟包被培养皿。将 freshly isolated APCs 接种于添加补剂的DMEM/F12培养基中，并孵育至细胞融合。
从第一天到第八天，使用MesenCult成脂分化培养基更换培养液。第九天，用PBS洗涤脂肪细胞两次，然后更换为含有DMEM、1% BSA和0.2% Primocin的成熟脂肪细胞培养基。为了分离脂肪细胞分泌的细胞外囊泡，首先将15毫升培养基通过40微米滤膜过滤，随后再通过30微米滤膜过滤。
将滤液在500g离心5分钟，然后将上清液在2000g离心10分钟，以去除任何残留的细胞和碎片。将所得上清液通过0.8微米滤膜过滤后，转移滤液至15毫升超滤装置中，在4000g离心15分钟以浓缩培养基。将浓缩后的样品上样至连接自动组分收集器的尺寸排阻色谱柱，收集组分F1至F8。进行Western印迹分析时，将每份组分从400微升浓缩至25微升。
加入50微升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液至浓缩样品中。加入75微升2× SDS上样缓冲液以变性样品，并在4%至12% Tris-甘氨酸凝胶上分离蛋白质。进行纳米颗粒追踪分析时，用0.1微米滤过的无菌PBS稀释细胞外囊泡样品，并轻轻混匀。
将稀释后的样品加入配备高灵敏度科学互补金属氧化物半导体相机和532纳米绿色激光器的纳米颗粒追踪分析仪中。设定检测粒径范围为10纳米至1,000纳米，浓度范围为每毫升10⁶至10⁹个颗粒。在共聚焦显微镜下，来自stop-flock-flock/CD63GFP小鼠的脂肪前体细胞未显示出可检测到的绿色荧光蛋白点状信号。
尽管来自AdipCD63小鼠的细胞在整个细胞质中显示出大量明显的绿色荧光蛋白点状结构。流式细胞术分析显示，在报告基因小鼠中，仅有1.2%的skull 1阳性细胞表达绿色荧光蛋白，而在AdipCD63-GFP小鼠中，该比例为12.6%。对尺寸排阻色谱组分进行的蛋白质印迹分析表明，细胞外囊泡标志物CD63和HSP70在F1和F2组分中富集。内质网和线粒体的标志物则未检出，证实了囊泡的纯度。
纳米颗粒示踪分析显示，脂肪细胞来源的细胞外囊泡大小在50纳米至500纳米之间，透射电子显微镜证实这些囊泡具有完整的双层膜结构。Western blot证实脂肪细胞中STX4基因被敲除。共聚焦显微镜显示，在野生型脂肪细胞中，CD63-GFP阳性囊泡在细胞质中广泛分布，而在STX4基因敲除的脂肪细胞中，这些囊泡则在质膜附近聚集。
与野生型脂肪细胞相比，STX4基因敲除脂肪细胞分泌的脂肪细胞来源细胞外囊泡浓度显著降低。对等量细胞内囊泡蛋白进行的蛋白质印迹分析显示，与野生型相比，STX4基因敲除脂肪细胞中CD63和CD81的表达水平降低。该实验方案提供了一个稳定且可重复的系统，可用于体内和体外研究脂肪细胞EV的分泌，并提供了一种优化的脂肪细胞EV纯化方法。
本方案首次描述并验证了采用连续低速离心结合尺寸排阻色谱法纯化成熟脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的方法。我们的研究结果使我们能够提出新的科学问题，探讨脂肪细胞在生理和病理条件下如何利用细胞外囊泡与其他细胞类型进行通讯。
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概述
本研究探讨了脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）及其在成熟脂肪细胞与前体细胞之间通讯中的作用。通过使用脂肪细胞特异性的CD63-GFP报告小鼠品系，该研究对EV的分泌进行了可视化和定量分析，揭示了脂肪组织内存在旁分泌通路。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 代谢
背景
- 脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中发挥关键作用。
- 目前缺乏用于研究脂肪细胞EV分泌的体内系统。
- 现有的EV纯化方案尚未完全优化。
- 深入了解EV有助于揭示代谢调控机制。
研究目的
- 明确脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）在脂肪组织中的作用。
- 探讨成熟脂肪细胞与前体细胞之间的相互作用。
- 建立一种可靠的体内研究EV分泌的方法。
使用的方法
- 采用无菌操作技术切除安乐死小鼠的腹股沟脂肪组织。
- 将剪碎的组织悬浮于消化缓冲液中进行分析。
- 使用Liberase和DNase I进行组织消化。
- 将样品在37摄氏度下于摇床上孵育。
主要结果
- 利用 CD63-GFP 报告基因小鼠可视化脂肪细胞分泌细胞外囊泡（EV）的过程。
- 定量分析前体细胞对细胞外囊泡（EV）的摄取。
- 揭示脂肪组织中的一种旁分泌信号通路。
- 建立在体研究脂肪细胞来源细胞外囊泡（EV）的实验方案。
结论
- 脂肪细胞来源的细胞外囊泡在脂肪组织内的细胞通讯中具有重要意义。
- 该研究为未来关于细胞外囊泡在代谢过程中的研究提供了基础。
- 优化的细胞外囊泡研究方法可加深对脂肪组织动态变化的理解。
常见问题
行业重要性概要
脂肪细胞来源的细胞外囊泡（AdEV）分泌是代谢组织间通讯中的一个关键但尚未充分研究的机制，在代谢疾病研究中的靶点验证和机制风险评估方面具有重要意义。CD63-GFP报告小鼠模型与优化的体外系统可实现对AdEV动态的精确定位和定量，有助于提高早期发现和转化研究的预测可信度。该平台增强了对旁分泌信号通路的探究能力，并可比较不同脂肪库来源的脂肪细胞EV特征，为风险调整后的研发管线决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 实现对AdEV分泌的直接可视化与定量，从而支持基于假设的目标验证。
- 通过阐明脂肪细胞向APC的旁分泌通讯通路，支持机制层面的风险评估。
- 促进不同脂肪组织库之间的比较研究，以提高生物学相关性和靶点可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供一种可重复的体外系统，用于标准化检测分化脂肪细胞的细胞外囊泡（EV）分泌。
- 通过共聚焦成像、流式细胞术和纳米颗粒追踪分析实现定量检测。
- 支持检测方法的可扩展性及平台重复使用，可用于筛选调控EV分泌或摄取的分子。
转化与临床前研究
- 通过实现特定脂肪库和特定基因型的脂肪源性细胞外囊泡（AdEV）分析，与疾病相关模型相契合。
- 通过将细胞外囊泡（EV）分泌动态与功能结果关联，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过对纯化的脂肪源性细胞外囊泡（AdEV）进行生化和功能分析，促进生物标志物的探索。
流程与工作流整合
该遗传学与体外实验平台整合了从早期发现到临床前研究的全过程，能够实现迭代的假设检验和机制验证。
- 发现生物学：通过细胞外囊泡（EV）支持脂肪细胞旁分泌信号传导的零假设检验。
- 筛选：提供标准化、定量的EV分泌检测方法，适用于化合物或基因扰动研究。
- 分析：提供可靠的检测读出，包括流式细胞术、Western blot 和纳米颗粒追踪分析，可用于不同条件间的比较。
- 转化研究：实现按脂肪库和基因型特异性的AdEV分析，以匹配疾病模型。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的平台，适用于多种脂肪组织和细胞外囊泡研究应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高脂肪组织信号传导研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化细胞外囊泡（EV）的分离与定量流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过阐明脂肪组织来源细胞外囊泡（AdEV）介导的通讯功能相关性，为“继续/终止”决策提供依据。
- 项目组合影响：实现对代谢性疾病靶点和通路的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备遗传小鼠模型、共聚焦成像和流式细胞术方面的专业知识。
- 需要使用用于细胞外囊泡纯化和纳米颗粒追踪分析的专用仪器。
- 要求跨团队在分离和定量方案上进行严格标准化。
- 可适用于多种脂肪组织库和分化方案，具有更广泛的应用性。
- 依赖经过验证的标记物和对照，以确保细胞外囊泡的纯度和特异性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Adipocyte Progenitor Cells from Inguinal Adipose Tissue
2:57
Confocal and Flow Cytometry-Based Detection of Secreted GFP-Tagged Adipocyte Extracellular Vesicles
4:52
Detection of Secreted Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles In Vitro
7:47
Results
9:58
Conclusion
