奈梅亨止血检测：在单个孔中同时进行凝血酶和纤溶酶生成的荧光测定

我的研究重点是通过同时测量继发性止血和纤溶作用来评估整体止血平衡。目前大多数检测方法仅评估凝血或纤溶的孤立组分，而该检测方法可在一次实验中同时测量这两个过程。

首先，打开荧光酶标仪，使其平衡至 37 摄氏度。在软件中配置滤光片设置，将波长对数量设为两对。凝血酶的激发波长设为 355 纳米，纤溶酶的激发波长设为 485 纳米。

然后将发射波长设置为凝血酶 460 纳米，纤溶酶 525 纳米。接下来，将板类型设置为 96 孔 Greiner 平底黑板。进入读取区域，并使用每板最多 20 个孔定义板布局。

通过将PMT增益设置为200伏特，每次读数闪光次数设置为六次，来配置PMT和光学参数。然后进入时间设置，确认总运行时间为1小时9分钟30秒，间隔时间为30秒。进入振荡设置，确认在第一次读数前有3秒的振荡。

导航至更多设置，确保读取顺序设置为按列。在读取前配置化合物转移参数：将化合物转移次数设为1次，初始体积设为120 µL。检查确认移液高度为130 µL，体积为20 µL，速率为1 µL/s，时间点为14秒。

在化合物来源中，确认选择 96 孔化合物板格式，并具体选择 Beckman 96 2.3 毫升选项。通过选择正确的列来确认移液器吸头布局设置。现在进入化合物吸头列，选择正确的列。

将微孔板摇床温度设置为 37 摄氏度，并在使用前确认温度。然后将振荡强度设置为 1，即每分钟 100 转。接下来，在 37 摄氏度水浴中解冻患者血浆和正常混合血浆，时间不超过 10 分钟。

充分混匀血浆样本，并确认已完全解冻，无可见的冷沉淀物。使用移液器，将80 µL患者血浆或正常混合血浆加入预先选定的孔中，每个样本使用新的移液器吸头。然后通过将48 µL脑磷脂与48 µL组织因子混合，制备底物混合液。

向其中加入 240 微升三钠氯化物缓冲液，然后用移液器加入 96 微升凝血酶底物和 48 微升纤溶酶底物。再将 20 微升底物混合物移取至每个孔中。随后震荡。

现在将微孔板插入荧光酶标仪中，并在37摄氏度下平衡数分钟。混合氯化钠三钠缓冲液、氯化钠三钠氯化钙缓冲液和组织型纤溶酶原激活剂，以配制起始试剂。充分涡旋混匀。

将起始试剂混合物移液至化合物列的所有行中。将含有起始试剂混合物的板插入源板架，并开始荧光检测。每30秒记录一次荧光信号，持续70分钟。

在整个检测过程中，将培养板保持在 37 摄氏度。进行数据分析时，将动力学荧光数据导出为表格，表格中包含每个孔的时间点及对应的荧光值。计算一阶导数，并绘制每个孔的酶生成曲线，以可视化凝血酶或纤溶酶随时间的生成情况。

止血检测能够同时、实时地测量凝血酶和纤溶酶的生成，从而对凝血和纤溶过程进行整体评估。从凝血酶生成曲线中可获得多个参数，包括滞后时间、峰值高度和凝血酶潜在值。较长的滞后时间、较低的峰值高度以及降低的凝血酶潜在值表明凝血酶生成受损。

纤溶酶生成曲线还可提供多个参数，包括纤维蛋白溶解时间以及纤溶酶峰值高度。较短的纤维蛋白溶解时间和较高的峰值高度反映了增强的血浆生成能力。来自三名健康对照者和正常混合血浆的凝血酶和血浆生成曲线显示出可重复的峰值高度及终点时间，可作为正常止血功能的参考曲线。

因子V活性为3%的患者完全无法生成凝血酶，但血浆生成仅略有增加。因子V活性为44%的患者凝血酶生成减少，表现为延迟时间延长、峰值高度降低，而血浆生成仍处于正常范围内。

在α-2-抗纤溶酶缺乏症中，随着α-2-抗纤溶酶活性的降低，血浆纤溶酶的生成增加。具有23%活性的纯合子患者表现出纤溶酶生成的早期启动、更短的纤维蛋白溶解时间以及更高的血浆峰值。在具有73%活性的杂合子患者中也观察到这些改变，但程度较轻。

止血检测非常适用于研究罕见的凝血因子缺乏症、纤溶障碍以及止血药物的作用。主要挑战在于技术的标准化和结果的归一化，以提高不同实验环境和实验室之间的可比性。未来的研究可能集中在实现该检测的自动化，并开发适用于全血或富血小板血浆的改进方法。