微流控技术在血小板功能评估中的应用

本研究的目的是在生理条件下评估血小板功能。我们特别利用微流控装置和生物表面来研究血小板功能。通过这一方法，我们能够回答与血小板功能障碍及止血复苏相关的问题，从而应用于输血医学领域。

目前的血小板功能检测方法通常通过特定激动剂来检测血小板的聚集能力。检测方法可能包括光透射法或电阻抗法，这些检测通常使用处理过的样本，并在静态条件下进行。通过采用这种微流控方法检测血小板功能，我们引入了流体动力学因素，从而增强了生理相关性。

流体动力学在止血过程中与血小板功能相关的生物学机制中起着关键作用。对于出血患者，我们尤其关注血小板的功能，以及可能增强该功能从而改善预后的治疗干预措施。通过这种血小板功能检测方法，我们能够在实验中追踪不同血小板群体的贡献，并为创伤及其他出血性疾病的治疗方案评估提供新途径。

首先，将硅胶弹性体基质倒入称量皿中。按照十比一的比例加入硅胶固化剂，并充分搅拌混合物，以确保硅胶聚合物链的适当交联。将母模放入培养皿中，并将未固化的PDMS均匀地浇注到模具上。

然后，将培养皿放入真空干燥器中30分钟，以去除混合物中的气泡。为完成PDMS的固化，将模具置于70摄氏度的烘箱中加热90分钟。PDMS完全固化后，使用剃刀刀片或解剖刀切割出微流控模具。

在通道的边缘打孔。现在，将玻璃载片和微流控模具的蚀刻面朝上放入等离子清洗仪中。启动真空泵并密封腔室。

然后，将等离子清洗机调至高功率档位，将装置放入清洗机中处理30秒。随后，关闭等离子清洗机并释放真空。为使经等离子处理的PDMS模具与载玻片结合，请轻轻按压在等离子清洗机中朝上的两侧表面，使其贴合。

将微流控装置置于70摄氏度的烘箱或加热板上10分钟，以完成结合过程。随后，通过指定的出口向指定的入口注入I型马纤维状胶原试剂，对微流控腔室进行包被。将装置存放在温暖、潮湿且密闭的容器中，以防止包被的胶原在通道内蒸发。

孵育1小时后，用PBS沿包被的相反方向冲洗装置，以彻底清除胶原溶液。首先，将枸橼酸抗凝全血与荧光标记的CD41抗体在选定的荧光染料条件下进行孵育。将血液在旋转摇床上避光染色30分钟。

接下来，打开显微镜及相关软件。将撤回式注射泵的高度调节至与显微镜载物台齐平，并根据实验要求调整注射泵的参数设置。然后，将微流控装置放置在显微镜载物台上，并用胶带将其边缘固定在载物台上，以防止移动。

现在，将内径为1/16英寸的管路连接至弯头接头，再连接到带有内径为1/16英寸接头的10毫升注射器上。用无菌PBS填充该10毫升注射器，并将其连接至注射泵。然后，将弯头接头插入微流控装置的出口。

准备长约10厘米的进样管，一端连接弯头接头，另一端切成斜角。将进样管的弯头接头连接至装置的进样口，并将进样管置于倾斜支架上的废液微量离心管中。使用10倍物镜聚焦于微流控芯片通道的边缘。

接下来，用 PBS 预先润洗管路。手动推进注射泵，以清除微通道中的 PDMS 或碎屑。检查微通道入口和出口附近是否存在堵塞。

现在，打开已保存的图像采集设置，或为每隔一到两秒采集一次的时间序列图像创建新的图像采集程序，图像应包含明场通道以及对应于血液样本中 CD41 抗体的荧光通道。取经过滤的枸橼酸抗凝血液样本，在实验开始前用移液器轻轻吹打混匀。将样本置于倾斜的微量离心管架上。

然后，将进样管插入血液样本中，并开始记录图像采集。缓慢回抽注射器，以充满管路中的死体积。一旦血液到达微流道，立即按下注射泵上的“运行”按钮，恢复至所需剪切速率的流动。

运行实验直至血小板完全闭塞微流控装置的狭窄区域，或达到实验终点（通常为10分钟）。实验完成后，停止图像采集，并关闭注射泵。最后，将图像采集数据保存至适当的存储位置。