一种简化的实验方法 农杆菌介导的转化 Phytophthora palmivora

本方案提供了一种简单、高效且可重复的系统，用于转化棕榈疫霉（phytophthora palmivora）和辣椒疫霉（phytophthora capsici）。首先，取一个添加了抗生素的新LB琼脂平板。将20微升LB液体培养基加入平板中央，然后用无菌的1.5毫升微量离心管从先前培养好的平板上刮取农杆菌细胞。

使用离心管的底部和平坦底面，将细胞均匀涂布在平板上。在28摄氏度下孵育平板过夜，时间约为16至18小时。随后，使用1毫升移液器吸头刮取过夜培养的农杆菌细胞。

用移液器反复吹打，将细胞重悬于1毫升农杆菌诱导培养基中。随后，将重悬的细胞转移至用铝箔包裹的无菌50毫升离心管中，并加入农杆菌诱导培养基。在600纳米处测定样品的光密度，并用农杆菌诱导培养基稀释，使光密度达到0.4。

然后松开装有细菌悬液的、用铝箔覆盖的试管盖。将其置于摇床上，以约70转/分钟的温和振荡速度振荡。用10毫升预冷至4°C的水浸润培养7至8天的棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）平板。

用移液枪枪头轻轻敲击表面，去除培养基上的任何气泡。将培养板在 4°C 下孵育 15 分钟，然后转移至光照下的室温环境中继续孵育 15 分钟。

使用移液器，轻柔地将约七到八毫升释放出的游动孢子转移至无菌的15毫升离心管中，注意不要扰动菌丝体和孢子囊。然后取20微升游动孢子悬浮液转移至1.5毫升微量离心管中，加入180微升水，使悬浮液稀释十倍。涡旋振荡该管一分钟，以确保游动孢子充分混匀，随后在显微镜下使用血细胞计数板对游动孢子进行计数。

在无菌的50毫升铝箔覆盖管中，加入5毫升制备好的农杆菌悬液至5毫升游动孢子悬液中。轻轻混匀管内物质，松开管盖，室温下静置2小时。孵育期间，准备AZCA平板。

待培养基凝固后，将一片灭菌的Hybond-N+膜置于平板上，并将平板置于黑暗环境中。共培养2小时后，用移液器枪头将300微升混合物均匀涂布于Hybond-N+膜上，注意确保液体不接触膜的边缘。将培养皿在通风橱中敞口放置约10分钟，使混合物自然风干。

当液体在膜上停止移动后，盖上培养皿。将盖好的培养皿置于25摄氏度黑暗条件下孵育两天。孵育48小时后，使用灭菌镊子将Hybond-N+膜倒置转移到Plich auger平板上，注意不要在auger表面拖动。

使用1.5毫升微量离心管的平底部分轻轻按压并滑过膜表面，以确保膜与培养基充分接触。检查培养板底部是否有气泡，并使用相同的平底部分轻轻按压排出气泡。将培养板置于25°C条件下，以12小时光照/12小时黑暗的周期培养2至3天。

最后，经过两到三天的培养后，使用无菌镊子移除膜，并在相同的光照和温度条件下继续培养平板。将表达 pCB301TOR-GFP 的根癌农杆菌 EHA 105 与棕榈疫霉（phytophthora palmivora）游动孢子共培养后，在添加了 30 微克/毫升 G418 的 Plich 琼脂平板上获得了对 G418 抗性的菌落，而在未接种根癌农杆菌的对照平板上未出现菌落。在实验一中，每 10 的 7 次方个游动孢子产生的 G418 抗性转化子数量为 55，实验二中为 50。

荧光显微镜证实了棕榈疫霉转化子中存在清晰的绿色荧光蛋白信号。此外，本方案已应用于辣椒疫霉，并成功获得了表达GFP的转化子。本方案使研究人员能够研究基因功能、确定蛋白质的细胞定位，并追踪病原菌的侵染动态。

该方案可能会产生少量假阳性结果，因此需要采用其他方法来确认真正的转化子。该转化体系的应用还可拓展至其他卵菌和真菌。未来我们还将尝试进一步简化该实验方案。