一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

本实验方案的总体目标是建立一种快速、自动化的高通量植物原生质体筛选方法，专门用于解决目前在大量基因组编辑和基因沉默靶点早期筛选中存在的瓶颈问题。该方法有助于回答植物生物技术领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于能够实现原生质体的高通量自动化制备与转化，从而对基因表达中启动子功能进行快速的平行筛选。

本实验将以广泛使用的烟草 Bright Yellow-2（BY-2）悬浮培养细胞为例进行演示。按照实验方案中的描述，首先在锥形瓶中培养 BY-2 细胞。在原生质体分离当天，充分混匀培养物，因为细胞会迅速沉降，然后将 6 mL 培养物转移至 15 mL 圆锥底离心管中。

让细胞静置至少10分钟。通过移除适量上清液，将压积细胞体积调整至总体积的50%。将离心管颠倒混匀，然后使用宽口移液器将500微升细胞悬液加入六孔板的每个孔中，用于消化。

该实验步骤的第一步是启动机器人系统的各个组件，包括微孔板移动器、液体处理仪、多功能酶标仪、多功能分液器、微孔板加热器或制冷器，以及计算机。接下来，打开微孔板移动器的任务调度软件，该软件可将微孔板移动器与其他设备集成，实现微孔板在各设备之间的转移。在微孔板移动器软件中，定义本实验方案所用耗材的技术参数。

单击主工具栏中的“设置”，然后选择“管理容器类型”命令。从现有容器类型列表中选择适当的容器类型。为板移液器将要接触的所有实验耗材定义技术规格。

下一步是为每个容器定义起始和结束位置。在特定方案中，点击“起始/结束”标签页。选择每个容器的起始位置，并在起始和结束位置均勾选“带盖”和“无盖”复选框。

在为每件实验器具定义起始和结束位置后，手动将所有板加载到整个工作流程的起始位置。将96孔荧光筛选板装入二号孵育槽，将含有BY-2细胞的6孔板装入三号孵育槽，将用于转化的96深孔板放置在加热/冷却板的二号巢位，将含有酶溶液的50毫升锥形管放置在多功能分配器上。为执行本方案中的转化步骤，预先在96深孔板的每个孔中加入10 µL含有橙色荧光蛋白报告基因构建体的质粒DNA，并在4 °C的加热/冷却板上孵育。

将所有耗材和培养板按照指定位置装载到自动液体处理平台上。在1号列装载一个96孔板，每孔预先加入200 µL 40%聚乙二醇溶液。在8号巢位装载一盒移液器吸头。

为了在自动化液体处理平台软件中定义每个组件的位置，请从菜单中选择“工具”，然后点击“耗材编辑器”。从下拉菜单中选择耗材类型。选择“主程序”选项卡，然后点击“配置耗材”以定义每件耗材的位置。

单击“运行”以初始化协议中将使用的所有设备。最后，在工作资源管理器窗口中，单击“添加工作单元”以核对系统中的所有实验耗材，并启动自动化协议。该实验过程中最敏感的环节是原生质体转化。

由于转化过程由机器人系统完成，因此正确设置自动化程序至关重要。在本视频中，仅展示自动化程序中的部分选定步骤。在转化程序期间，自动化液体处理平台从六孔板中吸取70微升原生质体溶液，并将其分配至第6个嵌套中的96深孔板中。

然后，使用新的移液吸头从预装好的深孔板中缓慢吸取70微升高粘度的聚乙二醇溶液，并将溶液完全排入深孔板中相应的孔内。接下来，自动化液体处理平台将深孔板从6号位移至9号位，由板移器抓取该板并将其转移至板振荡站，以1500 RPM振荡30秒。在静置孵育20分钟以使原生质体达到平衡状态后，板移器将96深孔板移至多功能分配器并启动洗涤程序。

当自动化原生质体分离与转化程序完成后，从机器人系统的1号培养舱中取出含有转化后原生质体的培养板。打开倒置显微镜、相机和荧光灯。选择10倍物镜，用于对原生质体进行初步聚焦。

打开卤素灯，并关闭荧光灯的快门。将培养板装载到显微镜系统上，使用明场聚焦于原生质体。随后，关闭卤素灯泡，并打开荧光灯的快门。

选择Cy3/TRITC滤光片以观察转基因原生质体表达的橙色荧光蛋白。逐孔扫描，确定表达荧光标记的原生质体数量。按照本方案指定条件进行酶消化，每六孔板可获得2,820,000个原生质体。

评估了实验方案中每一步转移后原生质体浓度的损失情况。在完成消化步骤后，将11,500个原生质体转移至96深孔板的每个孔中。在转化步骤完成后，将1,230个原生质体转移至96孔荧光筛选板中。

为确保多次移液操作不会损伤原生质体，采用碘化丙啶染色法检测其活力。结果显示，在消化后、转移至96孔荧光筛选板后以及转化实验程序后，原生质体活力均无显著差异。该转化程序成功获得了表达橙色荧光蛋白的转基因细胞，但转化效率较低，仅约2%。这主要是由于使用了较大的双元质粒，且该实验方案尚未针对BY-2原生质体进行专门优化所致。

该实验方案时间进程所获得的数据显示，大部分时间消耗在消化阶段。原生质体分离与转化的完整过程耗时为3小时50分钟53秒，期间无需操作人员额外干预。只要设置得当，该技术可由机器人在四小时内完成。

该技术问世后，正在为植物生物技术领域的研究人员开展高通量作物基因组操作（如基因组编辑和启动子筛选）铺平道路。