高效的聚乙二醇（PEG）介导的苔藓Physcomitrella patens转化方法

本实验的总体目标是转化 SCO 米氏原生质体。首先用 Drizly 处理植物材料以进行消化，随后用甘露醇洗涤原生质体以去除 Drizly，最后将原生质体与 DNA 和聚乙二醇（PEG）共同孵育。

最后，将转化后的原生质体接种到培养皿上并进行培养。最终可以获得结果，通过荧光显微镜观察到表达荧光标记蛋白的转化原生质体。本实验操作将由我实验室的博士后Y lu进行演示。

该技术的主要优点在于其高效性，并能稳定地产生表达目标蛋白的原生质体。分离苔藓原生质体时，首先用刮铲将9毫升8%甘露醇加入培养皿中。将来自两到三个PP NH4平板、培养5至7天的苔藓放入甘露醇溶液中。有关本步骤及其他试剂的配方，请参见随附的书面实验方案。接着，加入3毫升2% Drizly，在室温下轻轻振荡孵育1小时。

将混合物通过100微米筛网过滤，以获得绿色均匀的悬浮液。然后以250 ×g离心5分钟。小心弃去上清液。

将原生质体重悬于500微升8%甘露醇溶液中。然后加入额外的9.5毫升8%甘露醇溶液。确保原生质体充分悬浮。

再次以 250 G 离心五分钟，重复洗涤步骤两次。弃去上清液，并将原生质体重悬，首次重悬于 500 微升中。

然后使用血细胞计数板，取9.5毫升8%的甘露醇。对10微升原生质体悬液进行计数，以将DNA转化至分离的原生质体中。首先，将原生质体混合物在250 ×g下离心5分钟。

去除上清液，将原生质体以每毫升160万个的密度重悬于MMG溶液中。将悬液在室温下孵育20分钟。随后，将600微升原生质体溶液加入含有60微克DNA的培养管中。振荡混匀。

轻轻加入 700 µL PEG 钙溶液并混匀。在此期间，将样品在室温下充分孵育 30 分钟。用玻璃纸覆盖 PRMB 平板。

然后用三毫升 W5 溶液稀释悬浮液，在 250 ×g 条件下离心五分钟。去除 PEG 后，将原生质体重悬于两毫升 PRMT 溶液中，每张覆盖有玻璃纸的 PRMB 平板接种一毫升。将平板置于 25 摄氏度的培养箱中培养。

最后，在转化后的第四天，将羊皮纸膜转移到新鲜的选择培养基平板上。该图显示了由原生质体再生的18天龄植株示例，这些原生质体使用携带潮霉素抗性表达盒的15微克超螺旋质粒DNA进行转化。此处，将30微克相同的超螺旋质粒DNA转入原生质体中。

本样品中转化了60微克的格子状DNA。最后，这些植株由原生质体再生而来，这些原生质体被转化了120微克携带潮霉素抗性盒的相同超螺旋质粒DNA。转化效率不受高达60微克DNA浓度的影响。

然而，过高的DNA浓度会对该实验步骤产生不利影响。数据表明，该方法在较宽范围的DNA用量内均可获得稳定一致的结果，每学期进行一次即可。若操作得当，该技术可在三小时内完成。

通过此操作流程，还可进行瞬时RNA干扰和基因敲除等其他方法，以回答有关基因功能的更多问题。