戊型肝炎病毒荧光减量中和试验用于测定中和抗体滴度

基于荧光减少的中和试验主要目的是量化疫苗候选物及抗体对HEV的中和能力。由于HEV具有已知的细胞病变特性，限制了PRND检测的应用。本方案侧重于基于免疫学的PRND训练，以可视化感染细胞并进一步分析。首先，计数新分裂的HuH-7细胞。

然后，将一块显微镜级玻璃盖玻片放入12孔板中，每孔接种0.2百万个细胞，接种体积为1毫升完全DMEM培养基（含10% FBS）。将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，向接种的细胞中加入500微升无血清培养基，其中含有1.8 × 10⁴基因组拷贝的纯化g1-HEV。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育一小时。用500微升DPBS洗涤细胞三次。向孔中加入2毫升含2%FBS的DMEM培养基。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育72小时。用500微升DPBS洗涤细胞三次，每次洗涤之间在室温下孵育5分钟。向细胞中加入500微升4%多聚甲醛，并在室温下孵育20分钟。

然后，用 DPBS 按照之前的方法洗涤细胞。最后一次洗涤后，在室温下将细胞在 DPBS 中孵育 30 分钟。加入 250 µL 封闭液，封闭液含 5% 正常山羊血清、0.5% 牛血清白蛋白和 0.3% Triton X-100，溶于 DPBS 中。

在室温下于摇床上孵育一小时。移除封闭液，加入500 µL DPBS洗涤一次。然后加入250 µL一抗溶液，按1:500比例稀释。

将细胞在4°C条件下孵育过夜。次日，用DPBS洗涤细胞三次，方法如前所述。加入100 µL按1:1,000稀释的二抗，在湿化 chamber 中室温孵育1小时。

按照之前展示的方法进行洗涤和孵育循环。在载玻片上加入10 µL含DAPI的抗荧光淬灭试剂。将带有细胞的盖玻片朝向试剂封片，注意避免产生气泡。

用指甲油封固盖玻片，以供共聚焦显微镜观察。计数新传代的HuH-7细胞。随后，将一块显微镜级玻璃盖玻片放入12孔板中，每孔接种0.2×10⁶个细胞，加入1 mL完全DMEM培养基。

第二天，在无血清培养基中对抗ORF2抗体和兔免疫球蛋白G抗体进行10倍系列稀释，起始抗体浓度为每毫升25微克，最高稀释至10的负5次方。稀释后的终体积应为100微升。然后，向每种抗体稀释液中加入1.8乘以10的4次方拷贝的纯化g1-HEV基因组。

将抗体病毒混合物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。用500微升DPBS洗涤细胞。将抗体病毒混合物加入细胞中。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。用500微升缓冲液洗涤细胞。加入含2%胎牛血清的DMEM后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育72小时。

按照先前所述方法对细胞进行免疫荧光染色。获取荧光图像后，打开 ImageJ 软件。选择“文件”，然后打开图像。

然后，选择“图像”、“类型”，并点击“8位”以将RGB图像转换为8位格式。通过选择“图像”并点击“调整”→“阈值”，将下限设为40，上限设为255，以调整阈值。选择“分析”，点击“分析颗粒”，并启用“显示结果”、“清除结果”、“汇总”、“排除边缘”以及“复合感兴趣区域”。

然后点击“确定”以获取荧光斑点计数。根据所提供的公式，计算中和百分比及NT50（即Log10 NT50的反对数）。绘制图表，显示所有视野的平均值及标准差。

与模拟感染细胞相比，在感染细胞中检测到显著水平的g1-HEV核糖核酸。使用抗ORF2抗体进行的免疫荧光检测证实了感染的HuH-7细胞中存在ORF2表达。抗ORF2抗体的50%中和滴度估计为2.1 × 10³。

代表性图像显示了在荧光减量中和试验中模拟感染和g1-HEV感染的HuH-7细胞的形态。本方案可使研究人员研究抗HEV抗体的中和能力，并测定其50%中和滴度。该方案的关键步骤是感染性戊型肝炎病毒的分离、适当的细胞染色以及高分辨率图像的获取。

其他方法如RT-qPCR和ELISA可用于测定中和滴度，但这些方法存在一些局限性。