形态计量学分析：用于斑马鱼颅面形态定量分析的软件工具箱
2026年2月27日
本研究介绍了一种利用免费软件（tpsDigs2、MorphoJ 和 PAST）对斑马鱼幼鱼面部结构变化进行测量，从而定量分析颅面软骨形态的实验方案。
本研究采用形态测量软件，定量分析乙醇与bmp7a是否相互作用，导致斑马鱼出现细微的颅面缺陷。线性测量方法无法捕捉到细微变化。通过该方法，我们在控制大小差异的同时，利用标志点来量化形态变化。
首先，打开 tpsDigs2 软件。点击输入源，然后选择文件，并选取已保存的 TPS 记事本文件。点击选项以显示图像工具选项。
将参考长度设置为 100 微米，然后点击“设置比例尺”。单击“确定”以确认比例参数，然后退出图像工具窗口。接着，点击目标符号，并将第一个标记点放置在梅克尔软骨中线连接处的关节位置。
将第二个标志点置于梅克尔软骨与腭方软骨之间的双侧关节处。将第三个标志点置于角舌软骨中线的关节处，第四个标志点置于腭方软骨与角舌软骨之间的双侧关节处。然后，将第五个标志点置于舌颌软骨的远端末端，并确保在每张图像中标志点的放置顺序一致。
放置标记点后，点击“文件”以打开下拉菜单。选择“保存数据”，然后选择“覆盖”以保存更新后的文件。退出 tpsDigs2 软件。
启动 MorphoJ 软件。点击“文件”，选择“创建新数据集”，并为该数据集指定一个名称。点击 TPS，然后选择包含新添加数据点的记事本文件。
然后，创建数据集。在项目树中，点击该数据集。选择“初步分析”，然后选择“新建普氏拟合”。
选择“按主轴对齐”，然后点击“执行Procrustes拟合”。在“初步操作”下，选择“生成协方差矩阵”以获得Procrustes坐标。当系统提示时，执行该功能。
现在，选择创建或编辑线框，并将图像上的点连接起来。单击已连接的点，确认或创建图像，然后根据需要编辑分类器。在保持 MorphoJ 打开的同时，打开一个电子表格程序。
输入分类器信息，例如 GENOTYPE、TREATMENT 和 GENOTYPE TREATMENT，然后将文件保存为 CSV 文件。在 MorphoJ 中，单击“File”，选择“Import Classifier Variables”以导入 CSV 文件。返回项目树并单击数据集。
在“初步设置”中，选择“编辑分类器”以确认所有图像均已包含。在项目树中选择 CovMatrix，然后点击页面顶部的“变异分析”。选择主成分分析以计算主成分得分。
单击PC得分以显示生成的图形。在图形上单击右键，选择置信椭圆以添加所需的分类器。选择“为数据点着色”，分配颜色，然后单击“确定”以应用更改。
在“初步设置”中，选择屏幕底部的形状图的“设置选项”。选择线框图，并修改目标形状、起始形状及数字的颜色。选择变异分析，然后选择Procrustes方差分析。
将Procrustes方差分析结果导出至先前创建的电子表格文件。在MorphoJ中，选择项目树中的原始数据集。点击比较，然后选择典型变量分析。
选择分类变量“基因型”（GENOTYPE）和“处理”（TREATMENT），然后执行该功能。要导出结果，请点击“结果”（Results）选项卡，然后在结果页面上单击右键，选择“导出到文件”（Export to File）并保存结果。
在项目树中，选择典型变量分析，然后选择得分。点击文件，选择导出数据集，选择数据类型和基因型处理。将典型变量分析得分保存为 TXT 文件。
为准备用于PAST软件的文件，请在文本编辑器中打开保存的CVA得分文件。将左上角的“id”一词替换为“Label”，并保存编辑后的文件。打开PAST软件，点击“File”，然后选择“Open”以导入编辑后的CVA得分文件。
在导入窗口中，选择行和列的数据名称，并选择“制表符”作为分隔符，然后点击“导入”。在“显示”选项卡下，选择“列属性”。
在“类型”旁边的下拉菜单中，将第一列包含分类变量的列指定为组。选中主成分或典型变量的数据列。选择多元分析，然后选择检验，再选择多元正态性，以分别对主成分和典型变量数据进行正态性检验。
单击“类型”上方左上角的灰色空单元格以选中整个数据集。选择“多变量”，然后选择“检验”，并选择变体的多变量分析以执行分析。将MANOVA结果导出到先前创建的电子表格文件中。
对每种基因型和处理组的每条幼虫均采集了内脏颅骨的图像。在代表性图像中标注了内脏颅骨的软骨，并在每幅图像上放置了标志点，以生成带有标志点标注的数据集。主成分1约占总形态变异的34%，主成分2约占总形态变异的20%。
每个主成分均显示出相对于所有内脏颅骨平均形状的特定形态变异。主成分分析图显示，不同基因型和处理组之间的均值存在重叠，未出现明显的聚类。由于样本量较小，经乙醇处理的野生型幼体表现出较大的95%置信椭圆。
典型变量1表示在品红色线框中，相对于平均黑色线框，角鳃软骨关节出现轻微缩短或延长。典型变量2显示，在Meckel软骨-腭方软骨与腭方软骨-角鳃软骨连接处，仅在内脏颅骨的一侧发生内向位移。经乙醇处理的野生型幼体表现出较大的95%置信椭圆，其均值范围覆盖了所有其他组别。
对变异体的多变量分析揭示了基因型和处理的总体显著效应。样品安装的一致性是最大的挑战。倾斜的幼虫可能导致测量不准确并改变实验结果。
该方案可适用于不同的解剖结构，分析三维数据，生成线性测量指标，并有助于确定实验样本量。未来的研究将探讨其他基因型对乙醇的敏感性，扩大样本量，并将这一多功能工具箱应用于多种解剖结构。
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概述
本文介绍了一种详细的形态测量学方案，用于分析斑马鱼幼鱼在乙醇暴露后细微的颅面形态变化，重点关注基因与乙醇之间的相互作用。该方法利用基于标志点的几何形态测量学及多变量统计分析，对颅面骨骼变异进行量化与比较，以应对胎儿酒精谱系障碍（FASD）表型评估中的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 遗传学
- 形态测量学
- 毒理学
背景
- 胎儿酒精谱系障碍（FASD）涵盖由产前乙醇暴露引起的一系列身体、认知和行为障碍。
- 面部骨骼异常是FASD的典型特征，但其分析因遗传变异性和细微的形态变化而变得复杂。
- 斑马鱼由于与人类基因相似、体外受精、颅面结构保守以及幼体透明，成为有效的研究模型。
- 传统的线性测量方法可能遗漏细微或复杂的形态变化，因此需要采用先进的形态测量学方法。
研究目的
- 定量分析乙醇与bmp7a基因相互作用导致的斑马鱼颅面细微缺陷。
- 建立并展示一种基于标志点的颅面形态测量分析的可重复工作流程。
- 实现不同基因型和处理条件下面部形态的成对及多变量比较。
使用的方法
- 使用 tpsDigs2 软件在内脏颅面软骨图像上进行标志点定位。
- 使用 MorphoJ 进行普氏对齐、主成分分析（PCA）和典型变量分析（CVA）。
- 使用 PAST 软件进行多变量正态性检验和多元方差分析（MANOVA）。
- 统计结果的可视化及导出，用于进一步分析。
主要结果
- 主成分1和主成分2分别解释了总体形态变异的34%和20%。
- 主成分分析图显示，不同基因型和处理组之间的均值存在重叠，未见明显聚类。
- 典型变量分析揭示了内脏颅骨中细微且局部的形态变化，例如角鳃关节的缩短/延长以及特定软骨关节的内移。
- 多变量方差分析表明，基因型和处理对颅面形态具有显著的整体影响。
结论
- 形态测量学方案能够检测出线性测量可能遗漏的细微颅面形态变化。
- 样本固定方式的一致性对于避免测量伪影至关重要。
- 该工作流程可适用于其他解剖结构，并可在未来的研究中扩展至三维数据和更大样本量。
常见问题
行业高管相关性
对斑马鱼颅面形态进行定量形态测量分析，能够高分辨率地检测基因-环境相互作用引起的细微表型效应，例如与胎儿酒精谱系障碍相关的表型变化。该工作流程可提高早期靶点验证的预测可信度，并为发育毒性研究中的机制性风险评估提供支持。该方法适用于表型筛选和转化连续性至关重要的项目组合决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够探究影响颅面发育的基因-环境相互作用。
- 通过量化细微的形态学表型，支持功能靶点的验证。
- 通过对形态变异进行多变量统计分析，有助于揭示潜在作用机制并降低风险。
- 提高对发育毒性终点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游表型筛选工作流程制备经过验证的斑马鱼模型。
- 基于标志点建立标准化形态测量分析方法，以实现可重复性和可扩展性。
- 生成适用于化合物比较评价的定量结果。
- 支持基因-环境互作研究中的稳健分析方法开发。
转化与临床前研究
- 将斑马鱼颅面表型与FASD研究中与疾病相关的终点指标相对应。
- 通过定量形态学指标支持转化生物标志物的鉴定。
- 实现从早期发现到发育毒性临床前验证的连续性。
- 通过阐明细微的表型效应，降低推进决策的风险。
流程与工作流整合
该形态计量工作流程涵盖了从早期发现到先导物识别及临床前研究的全过程，支持在斑马鱼模型中进行假设验证和表型筛选。
- 发现生物学：量化基因-环境因素对颅面发育的影响，用于假设驱动型研究。
- 筛选：提供可重复、定量的形态数据，支持检测准备和化合物评估。
- 分析：提供主成分分析、典型变量分析和多变量方差分析结果，实现可靠的统计比较。
- 转化研究：将斑马鱼表型与人类相关的发育终点相联系。
- 企业级复用：该工具箱可适应其他解剖结构，并可扩展应用于更广泛的研发领域。
运营与企业影响
- 科学价值：提高发育毒性研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化形态测量分析，确保可重复性及跨研究间的可比性。
- 战略价值：为早期项目组合中的决策提供依据，优化资源配置。
- 项目组合影响：实现对基因-环境相互作用靶点的风险调整优先排序。
实施注意事项
- 需要具备形态测量分析和斑马鱼发育生物学的专业知识。
- 需要使用成像、标志点标注和统计分析软件（tpsDigs2、MorphoJ、PAST）。
- 要求严格的样本固定与定向，以确保结果的可重复性。
- 通过调整实验方案，可适用于三维数据及其他解剖结构。
- 样本量和固定的一致性对统计效能和准确性至关重要。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
