利用延时共聚焦显微镜观察 sox10:kaede 转基因斑马鱼品系中的颅面发育过程

以下实验的总体目标是生成神经嵴细胞迁移的活体延时录像，以展示发育中的颅面结构的形成过程。首先，将麻醉的转基因 SOX10 KD 斑马鱼固定在琼脂糖中，以尽量减少实验过程中的移动。随后，在共聚焦显微镜下对神经嵴细胞中的 KD 进行紫外光激活，使其由绿色转化为红色。

然后聚焦于光转化神经嵴细胞。在拍摄延时视频之前，对发育结构生成一个Z轴层扫图像。获得的结果显示了在转基因SOX10 KD斑马鱼胚胎中，颅部神经嵴细胞发育形成斑马鱼初级腭的过程。

与现有方法（如静态成像）相比，该技术的主要优势在于能够实时观察细胞迁移等复杂的发育过程。这使得研究结果更易于被科学界获取。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如神经嵴细胞来源的结构是如何形成的，以及PTO基因如何影响其发育。

为准备胚胎封片，使用125毫升锥形瓶将E3水与低熔点琼脂糖混合，通过微波加热溶解。然后加入三卡（Tricaine），将锥形瓶置于50°C水浴中保温，并选取在受精后60小时表现出明亮荧光的转基因斑马鱼KD胚胎。随后，用滤纸将每个胚胎转移至载玻片腔室中。

吸去多余的 E3 水，然后用琼脂糖溶液覆盖胚胎。使用移液器吸头将胚胎精确调整至背侧朝上，确保胚胎完全浸没在琼脂糖中。待琼脂糖凝固后，用含 0.015% 三卡因的 E3 溶液填充腔室载玻片，以进行光转化。

首先使用20倍空气浸润物镜对胚胎进行聚焦。然后按下显微镜上的L 100光源按钮，并在软件中选择通道。打开图标。

查看采集控制A一的设置，点击共聚焦设置按钮。接着，点击自动，并为通道1、2、3分别选择DPI 4 88和561.9，然后再次关闭窗口。随后关闭通道一和通道三，点击解除联锁按钮，再按下扫描按钮，从每秒一帧、高压200开始扫描。

开始关注目标细胞。逐渐将每秒帧数增加至每32秒一帧，并根据背景噪声将电压降低至100至120。当胚胎处于焦点时，用鼠标右键点击前，先抓住屏幕右侧边缘的绿色边框，将其缩小以覆盖需要进行光转化的区域。

将每秒帧数更改为1，高压值更改为200，然后按扫描。此时将可见光转换区域的放大图像。下一张图片。

通过打开通道一，将细胞转化五到六十秒，直至绿色KD信号几乎消失。然后关闭dappy通道。打开通道二和三，恢复至原始缩放倍数。

右键单击缩放窗口，选择“恢复至原始大小”，以检查目标细胞的光转化是否充分。通过菜单栏中选择“Capture Z Series”图标来设置Zack的范围。调整查找表或uts，以设置时间序列。

选择 A 一个简单的图形用户界面框，并勾选以下设置：每秒 32 帧采集一帧。尺寸设为 1024，平均次数根据单次循环中需要采集的 Z 层堆栈数量选择四次或八次 x。

接下来，进入查看采集控制中的ND序列采集并设置时间范围。然后点击连续，再点击Zack。按照之前演示的方法设置边界。

启动录像，向腔室中加入 E3 0.015% 三卡溶液，全天缓慢移动并完全填充腔室以进行过夜成像。成像完成后，通过点击“显示最大强度投影”从成像文件创建高质量视频。然后在图像上右键单击并创建新文档。

删除不必要的帧并调整LUTs。本视频展示了斑马鱼腭部发生过程，使用SOX10-K转基因品系标记颅神经嵴细胞，以追踪其发育形成初级腭的过程。在受精后60小时，腭部前端形成区域的细胞通过光转化从绿色变为红色。

当成对的骨小梁会合形成原发性腭后，继续追踪这些细胞直至其到达最终位置。本视频展示了因speck基因的morino介导敲低所导致的腭部发育异常，并引发口面部裂。以一个与斜行面部裂相关的基因——lb A基因为例进行说明。

在受精后60小时，前部筛板细胞的单侧光转化显示中筛板细胞与侧筛板细胞之间存在融合失败的现象。该缺陷类似于人类斜面裂发育的发病机制，即侧鼻突与上颌突之间融合失败。该技术为发育生物学领域的研究人员探索斑马鱼神经嵴细胞发育奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用该方法捕捉您所关注的发育过程。