药物处理后肝细胞癌类器官的生成及单细胞转录组学分析

我们重点关注肝细胞癌类器官对药物治疗的反应，以及其转化研究在实际工作中的变化。该方案适用于肝细胞癌类器官，也可根据需要调整用于其他肿瘤类器官系统。首先，建立肝细胞癌（HCC）患者来源的类器官，并为其接受治疗干预做好准备。

根据制造商说明书，用二甲基亚砜（DMSO）配制仑伐替尼储备液。使用前，立即用预热的培养基将储备液稀释至预定的工作浓度。配制足够体积的溶液，以确保所有孔中的终体积相等，从而使每孔中的 DMSO 浓度保持一致。

接下来，沿每个孔的孔壁加入含20微摩尔仑伐替尼的培养基，以避免干扰基质小滴。设置含有相同终浓度DMSO的溶剂对照组。将类器官在标准培养条件下孵育预定义的处理时间。

对于超过72小时的处理，每48至72小时更换一次含药物的培养基，确保所有孔板的更换时间表保持一致。在处理前记录明场基础图像。在处理期间以固定的时间间隔，使用相同的显微镜设置、放大倍数和视野位置采集图像。

对于基于形态学的治疗反应评估，所有图像应采用相同的曝光设置、放大倍数和分析阈值。通过计算每个时间点每孔或每个视野中类器官的总面积，并将数值归一化至基线水平，从而绘制类器官面积生长曲线。为测量类器官平均直径，需确定各个完整类器官的直径，并计算每孔的平均值。

接下来，通过计数形态上可识别的完整类器官来确定存活的类器官数量，同时排除任何碎片或塌陷的片段。如果在处理终点需要进行额外的整体活力评估，则根据制造商说明书进行三维发光活力检测。然后，绘制类器官面积随时间的增长曲线。

比较对照组与仑伐替尼处理组类器官的平均直径，同时比较各处理组中存活类器官的数量。应确保使用一致的成像时间表、纳入标准及分析参数，以保证实验的可重复性。

选择具有完整三维形态、含有足够单细胞捕获材料且无可见污染的类器官孔。使用相同的显微镜设置、放大倍数和视野选择标准，在消化前记录每个选定孔的明场图像。在对照组和处理组之间采集相同时间点的类器官，并在整个样本中保持一致的铺板密度、处理时间表和培养基更换条件。

从每个孔中完全吸除培养基。用预冷的 PBS 洗涤每个孔两次，以去除残留的培养基和碎片。向每个孔中加入 1 毫升预冷的细胞回收溶液，并在冰上孵育 20 至 30 分钟。

孵育期间每5至7分钟轻柔吹打一次，以促进基质溶解。使用宽口或剪口移液枪头将溶解后的材料转移至预冷的离心管中，以尽量减少剪切力。只有当基质基本溶解且仅剩少量可见凝胶残留时，方可进行酶解解离。

将回收的类器官悬液在4 °C条件下以300 ×g离心5分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于1 mL重组细胞解离酶中，在37 °C孵育5至10分钟。

每2至3分钟使用宽口P1000枪头轻柔吹打8到10次，以促进组织解离。当大多数类器官片段已分散为单个细胞，仅剩少量残余细胞团时，停止消化。随后，加入4毫升含2%胎牛血清的预冷PBS以终止消化反应。

然后，将悬液通过40微米的细胞筛过滤。用PBS洗涤一次，以去除残留的酶、细胞聚集体和碎片。使用台盼蓝排斥法计数细胞。

在确保细胞存活率达到85%或以上后，将最终细胞浓度调整为每微升700至1,200个细胞。排除含有过多碎片、大量死细胞、明显大块聚集体或解离不完全的样本。若存在聚集体，上样前需重复过滤。

在相同条件下对对照样本和处理样本进行操作，包括解离酶种类、消化时间、吹打次数、过滤方法、细胞浓度及上样策略。最后，在完成单细胞文库扩增后，进行单细胞测序。类器官在复苏后第1天至第6天期间，在标准的三维培养条件下存活并持续扩增。

第1天时，类器官呈现为小型致密结构，而到第6天时，其体积增大，并表现出明确的形态特征。与DMSO处理的对照组相比，经乐伐替尼（lenvatinib）处理的类器官更小，且形态发生改变。定量分析显示，与DMSO对照组相比，乐伐替尼处理后类器官的平均直径显著减小。

本方案使我们能够在处理后研究细胞状态、细胞组成和基因表达的变化。最大的挑战是保持细胞活力，并确保所有组别的处理过程简单且一致。在此步骤之后可进行细胞下游分析，包括聚类分析、差异基因实验分析、通路富集分析和转录调控推断。