使用反射光检测脂肪基质血管组分中的衰老现象
2026年6月5日
本方案介绍了利用反射光共聚焦显微镜对从人脂肪组织中分离的基质血管组分进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的客观、单细胞水平检测。该方法可与免疫细胞化学染色兼容，包含pH对照以实现定量评估，并且相较于传统的SA-β-gal染色，具有更高的灵敏度和更低的主观性。
我们研究了在不同脂肪沉积部位及代谢状态下（如肥胖和高胰岛素血症）的脂肪细胞衰老现象。传统的基于明场的SABG检测方法难以实现多重检测，且主观性强。我们的新方案主观性更低，并可实现多重检测。
首先，取出含有人体脂肪组织的离心管。将10克脂肪组织匀浆后，加入含有0.05% I型胶原酶的离心管中，以获得约一百万个基质血管组分（SVF）细胞。将50万个细胞分装至每个1.5毫升微量离心管中。
向试管中加入1毫升2%多聚甲醛以固定细胞。然后在室温下于摇床上孵育20分钟。以600×g离心10分钟，弃去上清液。
根据生产商说明书，使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒配制X-Gal染色液。将1毫升染色液分别加入三个新试管中，并使用1摩尔盐酸溶液或1摩尔氢氧化钠溶液将pH值调节至5、6和8。
使用校准后的 pH 计检测 pH 值。将 pH 已调节的 X-Gal 染色液加入每个含有 500,000 个细胞的标记试管中。在 37 °C 条件下孵育 24 小时，无需二氧化碳。
将细胞在600G条件下离心10分钟。去除上清液后，用PBS洗涤细胞，再在600G条件下离心10分钟。
去除上清液后，为了在异质性的基质血管组分（SVF）中鉴定内皮细胞，将细胞与内皮细胞特异性的CD31抗体或对照IgG一抗在4°C条件下孵育过夜。使用0.1% PBST在室温下于摇床上洗涤细胞三次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。然后在600 × g离心10分钟。
弃去上清液后，将细胞在室温下于摇床上与二抗孵育一小时。以600×g离心10分钟，去除二抗染色液。用PBST洗涤细胞三次，然后按照之前所示方法进行离心。
用抗荧光淬灭封片剂重悬细胞。将细胞悬液滴加到显微镜载玻片上，在室温下避光孵育过夜以固定细胞。次日，加入100 µL 100%甘油。
将盖玻片置于其上，并用指甲油密封。将制备好的载玻片放置在共聚焦显微镜的载物台上。在显微镜软件界面中，选择光路选项，并将分光镜设置调整为 T90R10。
接下来，在镜像设置中验证二级二向色镜（SDM）的截止波长值。在检测器菜单中，点击染料和检测器选择选项，以分配通道和激发波长。然后，在10%至15%的范围内设置每种特定激光器的激光功率强度百分比。在系列菜单的LSM部分，将Z选项切换为“开启”，并将Z步进尺寸设置为系统的最佳值0.74微米。
接下来，在Z轴设置菜单中，输入起始值，并根据膜信号定义Z轴层扫描范围，以捕获完整的细胞体积。在采集面板中，于LSM输入框内输入文件名及文件保存路径。然后点击LSM开始按钮，启动图像采集。
并将文件保存为显微镜的原始格式。采集完成后，使用Z轴导航箭头检查整个Z轴堆栈中不同染料的信号和焦点分布情况。将保存的原始文件上传至ImageJ。在“Bio-Formats导入选项”弹出窗口中，点击“确定”。
单击图像菜单以打开文件。从下拉选项中选择颜色，然后选择拆分通道选项，将不同通道作为独立窗口打开。接下来，通过图像菜单下的调整选项，调节亮度对比度并优化LUT值，以增强图像的可视化效果。
使用帧底部的 Z 轴滚动条浏览光学切片，以验证整个图像堆栈中的细胞特征。在“图像”菜单下选择“堆栈”，然后选择“Z 投影”功能，生成三维共聚焦图像的强度叠加投影。
在 Z 投影对话框中，定义起始和终止的切片范围。选择投影类型，然后单击“确定”以获得最终的二维复合图像。接下来，转到“图像”菜单。
选择“类型”选项，将图像类型调整为16位。然后，将图像保存并导出为16位TIF文件。将保存的图像导入CellProfiler 4.2.8版本，进行自动细胞分割、量化每个细胞的反射光强度，并将强度测量值导出至电子表格中。
在电子表格中，将衰老相关β-半乳糖苷酶阳性的阈值定义为pH 8条件下平均反射光强度加上三个标准差。若pH 6条件下细胞的强度值超过所建立的阈值，则将其归类为衰老相关β-半乳糖苷酶阳性。人SVF细胞的反射光衰老相关β-半乳糖苷酶染色在三个pH水平下均呈现出清晰且可重复的染色模式。
在 pH 5 条件下，由于内源性酶活性较高，大多数细胞显示出强信号。在检测标准值 pH 6 条件下，信号强度和频率降低，从而能够特异性地鉴定出与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞。在 pH 8 条件下，信号极微弱，可作为确定阳性阈值的基线。
检测灵敏度测试表明，在所有 pH 条件下，反射光成像均优于明场成像。在 pH 5 时，反射光显示出强烈的 X-Gal 沉淀，而明场仅能检测到最大的沉积物。在 pH 6 时，反射光能够识别出在明场中因信号过弱或弥散而无法观察到的阳性细胞。
在 pH 8 条件下，反射光成像检测到的信号极弱，与较低的酶活性一致，且在识别中等及较低活性水平的 X-Gal 沉淀物方面优于明场成像。总体而言，该反射光成像工作流程实现了对 pH 依赖性衰老相关 β-半乳糖苷酶及基于荧光的标志物（如 CD31）的同步检测，有助于在异质性 SVF 群体中以单细胞分辨率进行多特征衰老评估。本方案可在实现敏感且定量的 SABG 活性检测的同时，兼顾其他衰老标志物以及其他细胞标志物的分析。
我认为，主要的挑战在于初始的显微镜设置。但一旦该步骤得到优化，便可在不同实验中使用相同的采集参数。未来的研究可将此检测方法与其他亚细胞标记物相结合，以探究SABG与不同细胞过程之间的关系。
概述
本文介绍了一种优化的反射光共聚焦显微镜方法，用于定量检测人基质血管组分（SVF）细胞中与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性。该方法可实现客观的单细胞分析，允许同时进行多重免疫细胞化学染色以检测其他衰老或谱系标志物，并引入了pH匹配的对照。该方法为传统主观性SA-β-gal检测法在异质性原代细胞群体中的应用提供了一种灵敏且可重复的替代方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞衰老
- 生物标志物检测
- 共聚焦显微镜
背景
- SA-β-gal 是衰老细胞广泛使用的标志物，但传统检测方法依赖于主观的视觉评估。
- 这些局限性在异质性的人原代细胞群体（如脂肪来源的基质血管组分（SVF））中尤为显著。
- SVF 包含前脂肪细胞、免疫细胞和内皮细胞，使单细胞分析变得复杂。
- 目前亟需定量且客观的方法来检测复杂组织中的细胞衰老。
研究目的
- 开发一种优化的反射光共聚焦显微镜方法，用于高分辨率、定量检测SA-β-半乳糖苷酶。
- 实现对异质性人类SVF群体中单个细胞的客观分析。
- 允许同时进行免疫细胞化学染色，以多重检测衰老标志物和谱系标志物。
- 引入pH匹配的对照组，以提高检测特异性。
使用的方法
- 采用反射光共聚焦显微镜检测SA-β-半乳糖苷酶。
- 使用pH匹配的对照以区分特异性酶活性。
- 通过免疫细胞化学法共检测衰老标志物与谱系标志物。
- 采用单细胞图像分析进行定量测量。
主要结果
- 该方法可实现客观、定量的单细胞SA-β-半乳糖苷酶活性检测。
- 可通过免疫细胞化学方法同时检测其他衰老相关标志物或谱系标志物。
- pH匹配的对照组可提高特异性，减少假阳性信号。
- 该方法在异质性的原代人源SVF细胞中具有良好的可重复性和高灵敏度。
结论
- 优化后的共聚焦显微镜方法为传统的SA-β-gal检测提供了更优越的替代方案。
- 该方法可实现高分辨率、定量且具备多重检测能力的衰老检测。
- 此方法在研究复杂原代人类组织（如脂肪基质血管组分SVF）中的细胞衰老时尤为有价值。
常见问题
行业应用价值
在异质性原代人细胞群体中对细胞衰老进行定量检测，对于降低代谢性疾病和衰老相关疾病研究早期发现与靶点验证的风险至关重要。优化后的反射光共聚焦显微镜方法可实现对衰老相关β-半乳糖苷酶活性的客观、单细胞水平分析，有助于提高预测可信度并支持稳健的生物标志物评估。该技术能力通过在复杂的组织系统中提供可重复、多重检测的数据，从而增强项目组合的决策能力。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够客观地探究衰老作为一种机制性因素在疾病通路中的作用。
- 通过在单细胞分辨率下定量检测衰老标志物，支持功能靶点的验证。
- 提高在代谢和衰老相关适应症的早期项目筛选中的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为异质细胞群体中的衰老检测制备经过验证的定量检测方法。
- 通过pH匹配的对照和多重检测，促进检测方法的标准化和可重复性。
- 实现对化合物在原代人源细胞中影响衰老标志物的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将衰老生物标志物检测与疾病相关的人体组织系统相整合。
- 支持在代谢疾病模型中从发现到临床前验证的转化连续性。
- 在复杂的组织背景下提供用于风险评估决策的定量终点指标。
流程与工作流整合
该方法通过实现对原代人源SVF细胞中衰老的稳健、定量分析，可整合到从发现到临床前研究的连续过程中，支持靶点验证和转化生物标志物策略。
- 发现生物学： 客观量化衰老标志物，以阐明通路参与情况并减少机制上的模糊性。
- 筛选： 提供可重复的定量检测结果，适用于在异质系统中进行化合物筛选。
- 分析： 提供单细胞分辨率和多重读出，用于不同实验条件间的比较分析。
- 转化研究： 确保生物标志物与人类组织复杂性一致，实现临床前研究的连续性。
- 企业级复用： 建立标准化、可扩展的平台，用于跨多种研发项目的衰老检测。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对细胞衰老驱动疾病模型的预测可信度，减少不确定性。
- 操作价值：提升原代人源细胞工作流程中检测方法的可重复性、标准化程度和可扩展性。
- 战略价值：通过提供可靠的定量数据，支持科学的决策制定与资本高效配置。
- 项目组合影响：实现针对细胞衰老通路的资产进行基于风险调整的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜和定量图像分析的专业知识。
- 需要使用具备反射光共聚焦成像功能的仪器以及多重免疫细胞化学检测能力。
- 要求跨团队对实验条件和对照进行标准化，以确保可重复性。
- 经过适当优化后，可适用于异质性的原代人源细胞群体。
- 依赖严格的pH匹配对照，以确保衰老标志物检测的特异性。
