拟南芥细胞核中单分子定位显微镜的简化实验方案

我的研究重点是表观基因组编辑以及利用超分辨率显微镜对拟南芥细胞核内染色质结构进行可视化观察。现有的方法并不适用于STORM成像。本实验方案改进了细胞核纯度、标记一致性、样品封片以及成像稳定性。

该方法适用于拟南芥及其他植物系统，用于高分辨率研究细胞核结构、染色质结构和表观遗传学。首先，在通风橱内将六孔培养板置于冰上。混合固定液，其中包含4%（体积分数）甲醇稳定的甲醛、0.1% Triton X-100 和 PBS。

在通风橱内，向每个孔中加入约四毫升冰冻的固定液。使用洁净的镊子，从固体半倍浓度的Murashige和Skoog（MS）培养基上取出发芽后8至15天的拟南芥幼苗。立即将幼苗浸入固定液中，每孔放置约20株幼苗。

每个样品使用三个孔以获得足够的材料。将培养板放入装有冰的真空室中并关闭。在-0.6 bar至-0.8 bar之间进行15分钟的真空循环，以去除组织中的 trapped 空气，并使固定剂充分渗透到植物组织中。

然后缓慢释放真空。混匀样品，并继续抽真空15分钟。在通风橱中，用移液器移除固定液。

用5毫升冰冻PBS在温和振荡条件下每孔清洗三次，每次10分钟。清洗后弃去PBS。用镊子将固定好的组织转移至120 mm × 120 mm的培养皿中，并向固定后的幼苗加入50 µL细胞核分离缓冲液。

用刀片切碎固定组织。使用同一刀片将切碎的组织刮至培养皿的一侧边缘。加入 600 微升细胞核分离缓冲液，并冲洗掉粘附在刀片上的任何组织。

将组织匀浆液转移至一个2毫升的Dounce匀浆管中，先用较小的研杵研磨5到10次。然后换用较大的研杵继续研磨，直至其在管内移动顺畅，通常需要5到10次研磨。将匀浆后的样品通过30微米的滤网过滤至一个50毫升的离心管中。

将滤液转移至一个新的1.5毫升离心管中。以800×g离心10分钟，加速度和减速度均使用最低梯度。离心后，可见在绿色组织碎片中有一个微小的白色沉淀。

弃去上清液，将沉淀重悬于600 µL细胞核分离缓冲液中。再次以800 × g离心10分钟，并移除上清液。彻底洗去绿色碎片后，将分离的细胞核悬液于4 °C保存，最多可保存一周，并用目标抗体对细胞核进行免疫染色。

将1.5%（重量/体积）低熔点琼脂糖溶液在90摄氏度加热一分钟，以溶解粉末并获得澄清溶液。短暂涡旋以确保充分混匀。在继续操作前将溶液冷却并维持在37摄氏度，以避免葡萄糖氧化酶缓冲液发生热变性。

当低熔点琼脂糖溶液降至37摄氏度时，通过向其中加入100毫摩尔的巯基乙胺和葡萄糖氧化酶缓冲液，使低熔点琼脂糖中的终浓度达到1X，并轻轻混匀。将10微升的细胞核混合物滴加到经紫外线臭氧清洗系统处理20分钟的臭氧处理1.5H盖玻片上。静置3分钟，使细胞核沉积在盖玻片上。

然后，去除多余的液体，静置两分钟。向盖玻片上加入10 µL已制备的低熔点琼脂糖，立即用载玻片覆盖。使用硅酮密封剂密封盖玻片。

使用微量移液器吸头在小型培养皿中等量混合溶液A和溶液B。将混合物涂抹在盖玻片边缘，以密封样品。让硅酮密封剂固化五分钟。

将样本载玻片安装到显微镜上并找到焦平面。定位并聚焦于细胞核。如果设备支持，启用焦平面维持模块，以确保长时间采集过程中的稳定性。

选择一个或少数几个纳米金刚石靠近细胞核的区域，以在重建过程中提高漂移校正效果。对于双色成像，先从较长波长的通道开始采集，然后切换到较短波长的通道完成成像。使用 ThunderSTORM 对原始图像序列进行处理，采用加权最小二乘法的高斯拟合，并生成重建图像。

根据低于 30 纳米的 sigma 和不确定性进行滤波，以保留精确的定位结果并去除噪声。最后，使用 ThunderSTORM 互相关法或 COMET 算法进行样品漂移校正，并确认重建图像中的漂移极小。细胞核来自 15 天龄的野生型幼苗，用 AF647 标记的二抗进行免疫标记，并用 Hoechst H33258 复染。

共聚焦成像显示多个孤立且保存良好的细胞核，碎片极少，染色中心和核仁清晰可辨。RNA聚合酶II信号在染色中心和核仁中均不存在。衍射受限的最大强度投影及其对应的单分子定位显微镜（SMLM）重建结果揭示了RNA聚合酶II和DNA标记的结构细节，包括放大显示更精细结构的兴趣区域。

与检测到的定位相比，基于sigma值和不确定性的定位筛选改善了RNA聚合酶II和DNA信号的清晰度。在漂移校正后的进一步优化保持了这种增强的结构。基于sigma值的筛选去除了拟合宽度过小或过大的定位。

傅里叶环相关分析显示，AF647通道在滤波后分辨率从90.1纳米提高到47.7纳米，而JF549通道则从56.6纳米提高到27.9纳米。在最小化碎片和背景荧光的同时保持细胞核完整性，对于实现高质量的单分子成像至关重要。未来的研究可将核结构与环境或发育条件下的基因调控联系起来。