通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

50 多年前，人们曾提出假设，认为终末分化的细胞（如皮肤成纤维细胞）可被诱导转变为类似于胚胎干细胞的多能状态。这一概念的理论基础在于观察到几乎所有细胞类型都具有相同的遗传密码，细胞类型之间的唯一差异仅在于遗传密码的读取方式不同。将已分化细胞的细胞身份转变为多能状态的能力被称为细胞重编程。

经过五年的研究，最近发现强制表达四种转录因子可将皮肤成纤维细胞重编程为多能状态。这一发现具有重大影响。除了对基础生物学具有重要意义外，它还克服了使用人胚胎干细胞进行移植治疗所面临的主要伦理争议。

为了实现重编程，需要将编码四种转录因子 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 的四个基因进行包装，并导入慢病毒组织培养物中。随后，将含有纯化病毒的培养基加入到一个含有高密度成纤维细胞的细胞培养皿中，在该培养皿中，奇迹般的变化随之发生。其中一小部分成纤维细胞同时感染了携带这四种转录因子的病毒，并开始发生去分化。

它们的形态和增殖会发生显著变化，并开始分裂形成由多能干细胞组成的大球形细胞簇。在胚胎干细胞培养条件下培养两到三周后，可对重编程的成纤维细胞形成的克隆进行人工分离，并在体外扩增。一旦获得纯化，这些细胞可用于生成嵌合体小鼠，其中一定比例的细胞来源于去分化的成纤维细胞，并能够贡献于小鼠的不同组织。

在嵌合体中，若原始成纤维细胞的遗传物质能够进入生殖系，则其遗传密码便可传递给下一代，并持续传递给后续世代。尽管目前使用病毒递送系统对临床应用仍存在障碍，但这一问题有望在短期内得到解决。在本视频中，尹实验室的成员将演示如何从小鼠胚胎成纤维细胞中诱导生成多能干细胞。

大家好，我是来自马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所Rudolph Jish实验室的Grant Welted。这位是同样来自Ish实验室的Tobias Bro brink。今天我们将向您展示如何通过慢病毒导入四种cDNA——OCT4、SOX2、c-Myc和Klf4，来生成诱导性多能干细胞。这些慢病毒在Tet-O-CMV启动子的驱动下表达上述四种cDNA。

这使得在感染小鼠胚胎成纤维细胞后，能够精确控制这四个转基因的表达。我们今天向您展示的方案涉及慢病毒的操作，该病毒有可能感染人类细胞。您必须始终遵循安全操作规程，并在自行操作前联系您的安全管理部门。

因此，让我们生成一些诱导多能干细胞（IPS细胞），以产生能够将成纤维细胞转化为IPS细胞的慢病毒。需要将293细胞与三种质粒共转染：Paks2，它提供病毒包装所需的遗传元件；病毒骨架，即带有四种CD因子之一（c-Myc、T4、Sox2、Klf4或c-Myc）的FUW tEOCMV慢病毒；以及PMDG，它表达水疱性口炎病毒（VSV）的包膜糖蛋白。

这将产生致病性病毒，因此需要遵循相应的生物安全二级以上操作规程。在本视频中，我们并未实际操作具有感染性的病毒，因此未穿戴常规的防护服，也未在生物安全二级以上实验室内进行操作。

转染前，将293细胞从液氮中解冻，并培养至90%融合度。随后用FU基因转染细胞，并给予48至72小时以表达病毒。此时，用0.45微米滤器过滤培养细胞的培养基，并通过超速离心浓缩病毒。浓缩病毒后，即可用于感染MES细胞，以生成iPS细胞集落。在病毒制备过程中，使用传代次数少于三次的小鼠胚胎成纤维细胞，在10厘米培养皿中培养至90%融合度，每皿细胞数约为2×10⁶。在本项实验方案中，我们使用的MES细胞表达RTTA，这对于强力霉素诱导下内源性OC4位点的GFP表达至关重要。

MES 为 GFP 阴性，但真正的诱导多能干细胞（iPS 细胞）会变为 GFP 阳性。该标记提供了一种识别重编程细胞的方法。吸出成纤维细胞的培养基，用 10 mL PBS-EDTA 洗涤，弃去 PBS-EDTA，加入 5 mL 1× 胰蛋白酶，37°C 孵育 10 分钟。胰蛋白酶有助于使细胞从培养皿底部脱落。

现在加入9 mL培养基，重悬细胞以形成单细胞悬液，并转移至15 mL离心管中。随后将这些细胞离心并沉淀。重悬沉淀后，对悬液中的细胞数量进行计数，并将浓度调整为每毫升8 × 10⁴个细胞。

将10 mil的细胞悬液转移至经明胶包被的10厘米培养皿中。在37°C、5%CO2条件下培养过夜。过夜培养后，吸除成纤维细胞培养皿中的培养基，并向其中加入10 mil含病毒的培养基。将细胞在37°C、5%CO2条件下孵育4小时至过夜。

第二天，从成纤维细胞培养皿中吸除培养基，然后加入10 mL新鲜的ESL培养基。在此阶段，细胞可进行冻存、扩增或准备启动重编程。为启动重编程，将常规ESL培养基更换为含有强力霉素的培养基，以启动四个基因的表达。

将这些细胞放入培养箱中，并每天更换培养基，直到克隆生长至足够大以便挑取。克隆通常在重编程开始约一周后首次可见，到第20天左右应生长至足够大，可进行挑取。

现在已过去20天，我们可以开始挑选诱导多能干细胞（IPS）克隆。在挑选克隆之前，应提前一到两个小时准备好所需数量的经明胶包被且经γ射线照射的DR四层饲养层24孔板。在挑选前，需向孔板中的克隆加入新鲜培养基进行换液，并在挑选前立即向V型底96孔板的各孔中加入50微升HEPES缓冲液。用PBS将含有待挑选克隆的培养皿洗涤一次，并向该培养皿中加入10毫升PBS。IPS细胞集落可在体视显微镜或倒置显微镜下进行挑选。

用小型移液器吸头挑取菌落，并将其转移至含有 PBS 的 96 孔板中的孔内，以去除细胞团块。用移液器吸头在细胞团周围画圈，以打散团块。现在可使用多通道移液器提取重编程细胞，每孔加入 20 µL 胰蛋白酶。

将液体上下吹打混匀三次，在37°C下孵育4分钟。孵育4分钟后，向三份良好的菌落中各加入100 µL ES培养基。上下吹打混匀10次，每次转移6个克隆。

从96孔板转移至24孔板，使用12通道移液器，每隔一个位置使用一个吸头。随后将细胞在24孔板中置于37摄氏度、5% CO2培养箱内培养，直至细胞融合度达到80%至90%。用ES细胞培养基更换培养液，细胞通常在3至7天内可准备进行扩增。数天后，当iPS细胞达到汇合状态时，吸除培养基，加入1毫升Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞，彻底去除HBSS后，加入100微升1×胰蛋白酶溶液，于37摄氏度孵育10分钟。胰蛋白酶孵育结束后，加入400微升ESL培养基，通过上下吹打使细胞悬浮，形成单细胞悬液。

将24孔板中的500微升单细胞悬液转移至6孔板的一个孔中，置于37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育，直至细胞在6孔板中达到80%至90%融合度。此时，可选择继续扩增细胞用于Southern分析、流式分析、注射实验、畸胎瘤检测或体外分化检测。同时应记得冻存这些细胞的备份，以免丢失珍贵的iPS细胞株。

我们刚刚向您展示了如何利用可诱导的抗病毒系统在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导多能性。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。