秀丽斑马鱼多巴胺能神经元变性检测法在帕金森病潜在致病基因验证中的应用

在卡德威尔实验室，也就是俗称的“蠕虫小屋”，我们研究海兔中的神经系统疾病机制。在漫长而富有成果的实验之后，我们会进行一些娱乐活动来犒劳自己。大家好，我是亚当·奈特（Adam Knight），来自阿拉巴马大学生物科学系卡德威尔实验室的本科生。

今天，我和其他研究人员将演示如何在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行多巴胺能神经元变性检测。我将把一种多巴胺能神经退行性突变线虫品系与过表达候选致病相关基因及多巴胺能神经元的转基因品系进行杂交。大家好，我是亚当·Harrington（Adam Harrington），卡德威尔实验室的一名研究生。

今天我将向您展示如何准备用于多巴胺能神经元分析的转基因线虫。大家好，我是Shu Amichi，一名研究生。在这里，我将向您演示如何检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）的多巴胺能神经元，这些神经元被称为CEPs和ADEs。

通常情况下，仅在多巴胺神经元中表达GFP的线虫不会出现细胞死亡。然而，在存在CLE的情况下，您将观察到与年龄相关的神经元退行性病变。利用该检测方法，可在多巴胺神经元中共同表达一个转基因，以确定其是否能够增强或抑制CLE诱导的毒性。接下来，我们开始实验。

在进行多巴胺能神经元分析之前，我们必须首先将合适的GaN品系进行杂交，以开始在交配平板上培养八种品系，这些品系在多巴胺能神经元特异性启动子dat-1的调控下同时表达alphas核蛋白和GFP。现在加入两株L4期的转基因雌雄同体，它们在多巴胺能神经元中特异性表达我们感兴趣的候选基因，同时在体壁肌细胞中表达DSRed2荧光筛选标记。需要注意的是，针对每个转基因构建体，我们均建立三个稳定的转基因品系。

因此，该遗传杂交实验应针对所构建的三个独立稳定品系分别进行。两天后，再过两到三天，移除并丢弃雄性个体。检查F1代。

有若干雄性子代，表明交配成功。接下来，从每次杂交后代中挑选出同时带有来自父本的GFP荧光标记和来自hamadi亲本的DSRed2荧光体壁肌标记的Aphrodite L4期幼虫，分别将其中五个单独转移至新的培养板上。所转移的个体必须处于L4期，以确保其尚未发生减数分裂。

将雄性动物与平板上的其他动物一起培养，使其自体受精三到四天，以产生F2代子代。现在清理F2代子代以进行后续操作。挑选表现出两种中心标记的5至10只动物，分别转移至各自的平板中。

然后对F3代进行筛选，选择那些100%动物在多巴胺能神经元中表达GFP，并且部分动物在体壁肌细胞中表达DSRed2荧光标记的培养皿。这些动物将对α-突触核蛋白基因和GFP基因呈纯合状态，并且能够稳定遗传新构建的转基因。筛选完成后，即可进行多巴胺能神经元的分析。

开始神经元分析时，准备一个新鲜的培养皿，放入上一步中鉴定出的三个 F 代动物。为三个转基因品系分别设置培养皿。此外，将仅表达α-突触核蛋白GFP的菌株作为对照接种于培养皿中，让线虫生长至成虫期。

当线虫发育至成虫阶段后，从每条品系中转移30至40条转基因个体至新鲜培养板上。在20摄氏度条件下让其产卵5小时。5小时后，移除并弃去成虫。

将成虫置于20摄氏度下培养三至四天，使胚胎发育至L4阶段。随后，挑选约一百只转基因L4期动物，转移至含有0.04毫克/毫升5-氟-2-脱氧尿苷的培养板中。

这种核苷酸类似物通过抑制DNA合成，阻止下一代的发育。由于FDUR培养板对光敏感，需将培养板盖好并完全包裹，避免光照。为线虫分析制备琼脂糖垫。

这些材料需使用新鲜的，不得使其干燥。准备两张载玻片，每张载玻片上纵向贴有一条胶带。胶带起到间隔作用，以确保制成厚度一致的垫片。

在实验台上将第三张载玻片置于二者之间。三张载玻片并排放置，位置已确定。

在中心位置滴加一滴熔融的arus，迅速将另一张载玻片垂直叠加在agros上，并横跨所有三张载玻片。重复此操作，根据待分析样本的数量制备相应数量的额外垫片。待auger垫片准备好后，在22 mm × 30 mm的盖玻片上滴加6 µL浓度为3 mmol/L、11 mile saw麻醉剂。

选取40只成年动物放入液滴中，然后将盖玻片倒置在琼脂垫上。对其他每条线重复此操作。每条线评分30只动物，记录每个CEP和D神经元的存在情况。

使用配备落射荧光装置的复式显微镜，并结合允许观察 FITC 或 GFP 的滤光立方，我们将采用 endo G-F-P-H-Y-Q 滤光立方，在评分表上记录数据。野生型动物在全部四个 CEP 神经元和两个 ADE 神经元中均保持完整的 GFP 荧光信号。对于表现出 D 神经元荧光缺失的个体，将根据其表型判定为已知野生型或神经退变型。

这些神经元被记录为 LG 或 GFP 丢失。同样，可通过计数每只动物中丢失的神经元总数来评估变性程度，并且该群体需重复分析两次。每次试验每组使用另外 30 只动物。

对三轮分析中表现出野生型多巴胺能神经元的线虫总数取平均值。随后采用学生t检验进行神经保护作用的统计分析，显著性水平设为P值小于0.05。为比较对照组线虫与在多巴胺能神经元中过表达候选基因的品系，在卵线后不同时间点进行分析时，应根据经验确定合适的分析时间点。

例如，我们已确定，在发育后的第6天、第7天和第10天，分别有77%、87%和90%的alpha CLE加GFP动物表现出多巴胺神经元退化。因此，如果我们预测目标转基因可能促进神经退行性变，则将在第6天进行分析；同样，可能抑制神经退行性变的转基因则将在第7天和第10天进行分析。

我们刚刚向您展示了如何在秀丽隐杆线虫中进行多巴胺能神经变性检测。在执行该实验步骤时，需牢记以下要点：第一，在遗传杂交过程中应使用适当的标记物进行筛选；第二，用于杂交的雄虫和L4期HEDIS线虫应保持健康状态。

第三，务必仔细且一致地对 CEP 和 a DE 神经元进行评分。该步骤将使您能够快速检测可能增强或抑制 alpha alpha CLE 诱导的神经变性的遗传因子。就这些。

感谢观看，祝您的实验顺利。