重组胸腺培养

您好，我是Andrea White，来自伯明翰大学MRC免疫调节中心Graham Anderson和Eric Jenkinson的实验室。今天我将介绍一种用于建立再聚集胸腺器官培养的实验方案，该方法可用于研究T细胞分化过程中发生的复杂细胞间相互作用。在本实验开始之前，已分离得到胚胎期胸腺叶，并经过处理以清除所有淋巴细胞。

这可以在另一个视频中观察到。随后将类器官小叶解离，以获得基质细胞悬液。最后，将细胞重新聚集，形成再聚集的 fmic 器官培养物。

开始操作。在培养 5 到 7 天后，LO 即可进行解离以制备单细胞悬液。将 0.8 微米滤膜浸入含有 RPMI 1640 加 10% FCS 的培养皿中，用镊子轻轻推动未自行漂浮的纤维斜面。使用 1 mL 移液器将组织小叶转移至 1.5 mL 离心管中。

建议每个离心管中不超过 50 个肺叶。让肺叶在 1× 重力下自然沉降到管底，然后吸除上清液。用 1 mL PBS 清洗肺叶，再次让肺叶沉降到管底。

重复此步骤，共进行三次 PBS 洗涤，移除最后一次 PBS 洗涤液后，加入 600 微升含 0.25% 胰蛋白酶的溶液。将离心管置于 37 摄氏度培养箱中孵育 25 分钟。使用移液器配装 1 毫升蓝色吸头，轻柔吹打组织块 10 秒，然后放回培养箱中继续孵育 20 分钟后，用移液器反复吹吸组织块，直至完全解离。

获得单细胞悬液约需30秒。加入400 µL预冷的含10% FCS的RPMI 1640培养基以中和胰蛋白酶，于4°C、1000 rpm离心10分钟沉淀细胞，弃上清，用1 mL含10% FCS的RPMI 1640培养基重悬细胞（视需要而定），计数细胞。

通常情况下，从一个E15期的纤维性组织开始，我们预期每个二恶嗪叶中约有50,000个细胞。现在，我们已准备好在1.5毫升的微量离心管中形成聚集体fmic类器官培养物，并加入新制备的混合间质细胞。

与预选的CD4阳性CD8阳性成纤维细胞共同培养。我们建议基质细胞与成纤维细胞的比例约为1:1。所使用的细胞数量将取决于可获得的细胞数量以及拟进行的实验。

我们建议细胞总数至少为十万个，最多不超过一百五十万个。V型聚集体应足够大以保证可重复性，但又不能过大，以免中心部位细胞死亡。在1000转/分钟条件下离心10分钟形成细胞沉淀。在4°C条件下，小心组装器官培养滤膜。

用 P200 移液器将所有 a SUP 上清液从反应管中移除。涡旋震荡细胞沉淀 10 秒，形成悬液。体积应约为一到两微升。

将细胞悬液轻柔地滴加到精细拉制的移液管尖端，保持细胞悬浮液聚集在移液管尖端。在解剖显微镜下，小心地用口吸法将细胞悬液滴加至直径为0.8微米的滤膜中心。理想情况下，细胞应以直立液滴的形式分布成一个直径为1至2毫米的圆形区域。

如果悬液开始扩散，需先让悬液中的液体通过滤膜排出，再将剩余的细胞接种。将培养皿放入塑料密封盒中并封好。对于胸腺器官培养，将盒子置于培养箱中，聚集的培养物在培养18小时后会形成完整的结构。

经过四到五天的培养后，它们将产生 CD4+8- 和 CD4-8+ 两种成熟的 T 细胞亚群。以 50 个经二嗪处理的胸腺叶开始，应能获得足够数量的基质细胞，用于制备三至五个再聚集培养物。这些培养物通常呈现为结构完整的细胞团块，可用镊子从滤膜上推下而不会破坏其结构。

我们刚刚描述了研究F型上皮细胞介导的阳性选择的方法。该方法也可用于研究树突状细胞介导的阴性选择。最后，通过使用TCR转基因成纤维细胞或MHC I类缺陷型或MHC II类缺陷型基质细胞。

该系统可分别对 CD4 阳性或 CD8 阳性 T 细胞的选择进行研究。感谢收看。