Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Hallo, mein Name ist Ena und wir führen routinemäßig Genexpressionsanalysen im Labor durch. Diese Technik nutzen wir, um differentiell regulierte Gene zwischen Meth und dem Wildtyp zu untersuchen. Heute habe ich RNA-Proben vom Wildtyp und von Meth und wir werden zuerst eine C-Analyse durchführen.

Wir verwenden indirekte Markierungsmethoden, und der Vorteil dieser Technik besteht darin, eine Augenverzerrung zu vermeiden, die bei der direkten Markierung auftreten kann. Dazu verwenden wir RNA-Proben und zielen darauf ab, drei Mikrogramm RNA in einem Gesamtvolumen von 13 Mikroliter zu erhalten. Anschließend geben wir 2,5 Mikroliter zufällige Primer in unsere Proben hinzu.

Und wir inkubieren die Probe bei 75 °C, um die RNA zu denaturieren, für acht Minuten. Danach fügen wir die Reverse-Transkriptions-Cocktailmischung hinzu, die AMV-RT, dNTPs, Puffer für die Reverse Transkriptase sowie ET und TT enthält, und inkubieren die Probe bei 42 °C für vier Stunden. Nach vier Stunden nehmen wir die Proben einfach heraus.

Und nun haben wir im Reagenzglas eine Mischung aus cDNA und RNA. Was wir nun tun möchten, ist die Hydrolyse der RNA, indem wir Natriumhydroxid und EDTA hinzufügen. Die Endkonzentration von Natriumhydroxid sollte hundert Molar betragen und die Endkonzentration von EDTA fünf Molar.

Und nun inkubieren wir die Proben 10 Minuten lang im Wasserbad bei 65 Grad. Die Inkubation ist abgeschlossen, und wir werden die Proben verwenden, indem wir pH-7-Puffer und Wasser zur Endkonzentration von 500 molar hinzufügen. An diesem Punkt können Sie die Proben bei minus 20 lagern oder mit der Reinigung fortfahren.

Für die Aufreinigung der cDNA verwenden wir das KaiGen-PCR-Reinigungs-Kit. Da jedoch der Bush-Puffer und der Ionenpuffer Freising enthalten, bereiten wir stattdessen unseren eigenen Fate-Bush-Puffer und Fate-Ionenpuffer zu. Danach geben Sie 300 Liter PPI hinzu, und Sie pipettieren diese Probe langsam ab. Anschließend überführen Sie das Gemisch in Säulen und zentrifugieren eine Minute bei maximaler Drehzahl. Danach waschen Sie mit dem von uns zubereiteten Phosphatwaschpuffer, indem Sie 750 Mikroliter hinzufügen, und wiederholen diesen Schritt erneut.

Wir werden erneut zentrifugieren, um sicherzustellen, dass wir alles vollständig abgetrennt haben. Anschließend überführen wir diese Röhrchen in leere Reaktionsgefäße. Dann gebe ich 30 Marker Phosphat-Puffer hinzu, der aus vier Molaren Kaliumphosphat bei pH 8,5 besteht.

Und hier müssen Sie sicherstellen, dass Sie alles in die Mitte der Säule geben, und Sie inkubieren bei Raumtemperatur für eine Minute. Dann wird erneut eine Minute lang zentrifugiert, und ich gebe einen weiteren 30-Mikroliter-Puffer hinzu, den ich bei Raumtemperatur inkubiere. Danach entferne ich die Säule, und wir erhalten ein Gesamtvolumen von 60 Mikrolitern an CDA.

Nach der Reinigung der cDNA können Sie diese bei minus 20 Grad lagern, und wir können sie außerdem trocknen und dann lagern, sodass wir die cDNA im Vakuum trocknen können. Jetzt haben wir im Reaktionsgefäß trockene cDNA, die modifiziert ist. Als Nächstes werde ich die trockene Probe in

Ich werde die Probe in 10 µL einer Lösung aus 15 µL LAR-Bicarbonat bei pH 9 suspendieren. Und ich werde dies durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren durchführen; in diesem Schritt ist es sehr wichtig, die cDNA vollständig zu resuspendieren. Damit die Transkription funktioniert, sollte diese Reaktion im Dunkeln erfolgen, da fluoreszente Markierungen lichtempfindlich sind.

Jedoch stammen diese aus den Lebenswissenschaften, und sie kamen in einzelnen Verpackungen. S fünf hat eine violette Kappe und Seite drei eine orangefarbene Kappe, und außerdem erscheint S fünf cyan, wenn es suspendiert wird, und Cary erscheint magenta. Was ich also im Dunkelraum tun werde, ist, diese Proben in Farbröhrchen zu überführen, die Farbe erneut zu suspendieren und sie anschließend zurück in das Röhrchen zu überführen, das ich habe.

Danach inkubiere ich zwei Stunden im Dunkeln; nach dieser zweistündigen Inkubation stoppe ich die Reaktion durch Zugabe von 35 µL einer 100 mM Natriumacetat-Lösung bei pH 5,2. Anschließend reinigen wir mit einem ähnlichen Aufreinigungsverfahren. Dieses Mal verwenden wir jedoch den von Cajun bereitgestellten Waschpuffer und Elutionspuffer.

Sie können die Stellen beschreiben, an die Sie die Probe gegeben haben, und das sollte das Instrument reinigen. Sie können also Ihre Probe oder Ihre Mischung jetzt einfügen. Das hier ist meine mit scifi markierte Probe, und was wir hier sehen, ist OD 260, das den CDA-Gehalt anzeigt, und OD 650, das die D-Inkorporation für scifi anzeigt. Und hier ist meine mit side three markierte Probe.

Erneut sechs Konzentrationen und fünf 50-Maßnahmen verdrillen, Standort drei Integration. Da meine D-Korporation effizient arbeitet, werde ich Proben kombinieren. Jetzt, Ms. Miss es kurz. Und nun werden wir eine Probe erneut unter Verwendung von Rückmeldung schreiben.

Okay, zur Rehydrierung des Objektträgers stellen wir den Objektträger universell auf Wasser, wodurch die Flecken größer werden. Um dies zu schützen, trocknen wir ihn kurz bei hundert Grad Celsius und vernetzen oder hybridisieren die Flecken anschließend durch UV-Bestrahlung fest auf dem Objektträger. Danach inkubieren wir ihn in dem vorliegenden Hybridisierungspuffer. Ich lege den Objektträger also mit der Oberseite nach unten, berührt das Wasser jedoch noch nicht.

Und wir warten so etwa fünf Minuten. Ich, dieser Kasten sieht größer aus, sie sollten glänzender sein als zuvor, bevor Sie sie hineingelegt haben, und Sie trocknen sie einfach, indem Sie den Objektträger auf einhundert Grad stellen und auf Kondensation achten. Und wir werden mit Ihnen vernetzen.

Bei der Hydrierung tauche ich das Objektträger einfach in vorgewärmtes Wasser. Dies sollte sehr schnell erfolgen, da das Ziel darin besteht, alle nicht gebundenen Oligos von der Stelle zu entfernen. Wenn Sie bei diesem Vorgang zu langsam sind, entstehen an Ihren Stellen nur Kommaschweife.

Stellen Sie also sicher, dass Sie dies wirklich schnell durchführen, und achten Sie darauf, dass Sie Ihre Probe nicht aus dem Wasser nehmen, und führen Sie diesen Schritt 30 Sekunden lang durch. Zentrifugieren Sie anschließend unverzüglich bei Raumtemperatur für fünf Minuten mit 700 Luft-pm. Nehmen Sie dies, wir passen diese Objektträger in den vorgewärmten Pufferbehälter, den wir vorbereitet hatten, und schieben den Objektträger langsam in das Gefäß. Anschließend inkubieren wir dies bei 42 Grad für mindestens 45 Minuten. Hier haben wir unsere getrocknete Probe, die hybridisiert werden soll. Zunächst resuspendieren wir sie in Wasser.

In diesem Schritt resuspendieren wir einfach durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und vermeiden, dass die Probe zu lange dem Licht ausgesetzt ist. Anschließend geben Sie 1,5 µg Spermien-DNA hinzu, deren Konzentration 10 Milligramm pro Milliliter beträgt. Außerdem fügen Sie 1,2 µL TRNA hinzu.

Die Konzentration beträgt 12,5 Milligramm pro, wir geben tRNA und Spermien-DNA hinzu, um unspezifische Bindung zu blockieren. Und wir geben 5,35 Marker Null drei XSSC hinzu, was eine Endkonzentration von drei x ergibt. Und schließlich geben wir 3,5 Mikroliter 1 % SDS hinzu.

Jetzt werden wir die Mischung fünf Minuten lang kochen und anschließend fünf Minuten lang mit höchster Geschwindigkeit zentrifugieren, danach ist sie bereit für die weitere Verwendung. Es ist bereits eine Stunde vergangen, seit wir unseren Objektträger inkubiert haben, und im Moment habe ich Wasser und Isopropanol zur Verfügung. Daher werde ich den Objektträger zuerst in Wasser schwenken, um das SDS zu entfernen, anschließend mit Isopropanol waschen und ihn direkt in die Standardvorrichtung geben.

Und hier achten Sie darauf, dass das Licht nicht zu stark der Luft ausgesetzt wird, um Austrocknung zu verhindern. Daher gehe ich direkt vom Puffer des Harm-Station in das Wasser und wasche die Probe. Einige Minuten lang – stellen Sie lediglich sicher, dass die Bewegung ausschließlich auf- und abwärts erfolgt, nicht seitlich.

Und stellen Sie außerdem sicher, dass der Objektträger nicht über dem Wasser liegt, und überführen Sie ihn sofort in Isopropanol. Lassen Sie ihn hier erneut einige Minuten lang stehen. Könnten Sie Ihre Probe bitte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren?

700 R.Cool. Unser Objektträger ist also ebenfalls bereit zur Hybridisierung, und es ist besser, ihn zum Schutz vor Erschütterungen in einer Objektträgerbox aufzubewahren. Für die Ernte-Station verwenden wir Lift oder Slip.

Es gibt weiße Streifen auf dem Deckglas, die einen Abstand schaffen und Platz für unsere Probe zwischen Deckglas und Objektträger bieten. Ich reinige es mit Ethanol und lege dann den Draht ab und stelle sicher, dass sich kein Testpartikel befindet. Zuerst nehmen wir unseren Vorlagen-Objektträger, bei dem der Druckbereich markiert ist, und darauf legen wir den vorbereiteten Objektträger, wobei wir sicherstellen, dass sie perfekt ausgerichtet sind.

Stellen Sie sicher, dass sie perfekt ausgerichtet sind. Außerdem müssen Sie darauf achten, dass die Streifen an der Seite liegen, die wir nach unten drehen werden. Es ist also wirklich schwer zu erkennen, aber vergewissern Sie sich, dass Sie es sehen können.

Die Streifen sollten sich an den Seiten der Objektträger befinden. Wir werden unsere Probe von den Seiten her auftragen. Ich nehme kleine Mengen der Probe, zunächst 15 Mikroliter, und beginne am Eck des Deckglases mit dem Auftragen.

Langsam ziehe ich ihn ein und bewege mich entlang der Kante, um den gesamten Bereich abzudecken. In diesem Stadium ist es sehr wichtig, keine Blasen einzuführen, und ich nehme einen weiteren 15-Migrator und trage ihn an die Seite der Objektträger auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Unser Probenpräparat ist nun fertig und Sie inkubieren die Objektträger in Priorisierungskammern, die Mikrokanäle enthalten, um den Objektträger während der Hybridisierung zu befeuchten.

Und wir geben 10 µL einer 3× SSC-Lösung in die sechs Ecken der Kammer. Es gibt sechs Stellen an der Kammer, entschuldigung, an jeder Ecke und an jeder Seite. Achten Sie darauf, die Objektträger sehr vorsichtig zu übertragen, damit das Deckglas nicht verrutscht. Wenn Sie den Objektträger mit der richtigen Seite nach oben platzieren, werden Sie sehen, dass es an dem Wasser haftet, das Sie hinzugefügt haben, und das Deckglas befestigen. Achten Sie darauf, dass die Schrauben fest angezogen sind.

Wir inkubieren die Hybridisierungskammer bei 65 Grad in einer Wasserwanne, stellen sie aber nicht direkt auf den Boden. Stattdessen legen wir eine Art Kunststoffbarriere ein, um einen übermäßigen Wärmeübergang zu verhindern. Anschließend stellen wir die Hybridisierungskammer vorsichtig darauf und können zusätzlich ein Gewicht verwenden, um eine Verschiebung zu vermeiden.

Und diese Inkubation erfolgt über Nacht, typischerweise zwischen 10 und 12 Stunden. Zum Waschen des Schnitts verwenden wir 1x SSC mit 0,05 Prozent SDS. Dies dient dem Entfernen der Deckglasabdeckung.

Und dies dient zum Waschen des ersten Schritts. Wir führen noch zwei weitere Schritte nur mit 0,06 % six XSC durch, um alle vorhandenen SDS zu entfernen. Dazu schließen wir die Küvette und nehmen die Objektträger heraus, um sie mit der Oberseite nach unten in einen Becherbehälter zu legen.

Und wir schütteln es einfach von Seite zu Seite, und wir werden sehen, dass der Deckgläser sanft abfällt. Gut, und dann überführen wir es in ein anderes Waschpuffer, der XES enthält. Sie inkubieren für eine Minute.

Bewegen Sie sich in Richtung oh sechs XSSC. Um sicherzustellen, dass wir alle FDS vollständig entfernt haben, wiederholen wir den Vorgang noch einmal. Zentrifugieren Sie, um das Waschmittel bei Raumtemperatur fünf Minuten lang bei 700 RP zu trocknen. Bewahren Sie diesen Objektträger in der Objektträgerbox auf, da er lichtempfindlich ist.

Hierbei handelt es sich um einen Objektträger-Scanner, bei dem Sie den Objektträger hier hineinlegen, genau in diesen kleinen Zwischenraum, und zwar mit der Oberseite nach unten und der Beschriftung nach vorne. Beim zweiten Objektträger legen Sie einfach den Bereich fest, den Sie scannen möchten. Sie erfassen dann lediglich diesen Bereich auf unseren Objektträgern. Wir verwenden 16 Pins, um unsere Objektträger zu bedrucken.

Jeder Block entspricht also einem Pin, und unsere Objektträger enthalten über 8.000 Flecken. Wir stellen das Vi-Farbstoff-Genom zweifach dar, da es etwa 4.000 Gene umfasst. Daher haben wir zwei Flecken pro Oligo, das wir verwenden.

Und wenn man hier hineinzoomt, sieht man in diesem speziellen Experiment, dass wir Transkriptionsregulator-Mutanten mit dem Wildtyp vergleichen, wobei die Mutante mit scifi markiert ist, was eine rote Farbe ergibt. Der Wildtyp war Standort drei, was eine grüne Farbe ergibt. Alles, was rot erscheint, wie diese Flecken, zeigt an, dass die Häufigkeit der Transkripte in der Mutante höher war als im Wildtyp.

Sie erscheinen also rot oder in Rottönen, und alles, was grün erscheint, zeigt an, dass die Menge des Transkripts im Wildtyp im Vergleich zum Mutanten höher war. Jeder Punkt, der gelb erscheint, zeigt an, dass dieses Transkript in Mutant und Wildtyp gleichermaßen vorhanden war. Wenn sie überlagert werden, erscheinen sie gelb, wie diese Stellen.