Bewertung von immunologisch relevanten dynamischen tertiären strukturellen Merkmale der HIV-1 V3-Loop Crown R2 Sequence durch Ab initio Folding

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die dynamischen strukturellen Präferenzen der V3-Kronen-Peptidsequenz des R2-Stamms von HIV mittels AR-Faltung zu bewerten und die Ergebnisse mit den bekannten Neutralisierungsempfindlichkeiten des R2-Stamms zu korrelieren. Dies wird erreicht, indem ein geeignetes Fragment der V3-Schleifenkrone des R2-Stamms zur Faltung von AR bonni ausgewählt wird. Als zweiter Schritt erfolgt die Simulation der Faltung, welche alle möglichen Konformationen des R2-Kronen-Fragments durchsucht und die wahrscheinlichsten Konformationen in einer Stapel-Datei aufzeichnet.

Anschließend werden die aufgezeichneten Konformationen analysiert, um die dynamische strukturelle Präferenz der R2V3-Krone zu ermitteln, die deren Empfindlichkeit gegenüber Neutralisation erklären könnte. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Präferenz für einen starren Beta-Faltblatt-Abschnitt an den Positionen 12 bis 14 der V3-Schleife aufgrund der Sekundärstruktur, der Präferenz und der Energieverteilung des Stapels der durchsuchten Konformationen aufzeigen. Hallo, ich bin Timothy Cardozo und spreche zu Ihnen aus meinem Labor in der Abteilung für Pharmakologie an der New York University School of Medicine.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur ab initio-Proteinfaltung einer flexiblen Schleife an einem immunogenen viralen Protein des HIV-1, das als GP120 bekannt ist. Die flexible Schleife wird als V3-Schleife dieses Oberflächen-Envelope-Glykoproteins des HIV-1-Virus bezeichnet, und ihre Spitze ist als Krone der V3-Schleife bekannt. Dies ist der Bereich, den wir falten werden.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um produktive Wege hin zu erfolgreichen HIV-Impfstoffdesigns identifizieren zu können. Beginnen wir also. Wählen Sie zunächst die V3-Krone-Sequenz aus, die in silico gefaltet werden soll.

Frühere Studien dieses Labors deuten darauf hin, dass die Positionen 10 bis 22 jeder V3-Schleifensequenz die besten Ergebnisse liefern. Führen Sie die Armenio-Faltungsversuche mit den benutzerfreundlichen Dropdown-Menüs in der grafischen Benutzeroberfläche oder GUI der ICM-Pro-Molekülmodellierungssoftware durch. Zunächst muss die dreidimensionale atomare Struktur des Peptids, das dieser Sequenz entspricht, im virtuellen Raum „ace“ des Computers aufgebaut werden. Um die dreidimensionale atomare Struktur aufzubauen, gehen Sie zum Menü „Datei“ und wählen Sie „Neu“.

Dadurch wird ein Bildschirm mit mehreren Registerkarten angezeigt. Wählen Sie die Registerkarte Peptid aus und fügen Sie die Sequenz in das Textfeld ein oder geben Sie sie ein. Klicken Sie auf OK, um die dreidimensionale Struktur des Peptids aufzubauen.

Die Struktur wird im grafischen Fenster von ICM angezeigt. Sobald die dreidimensionale Struktur erstellt wurde, wechseln Sie zum Menü der molekularen Mechanik und wählen Sie „minimieren“, woraufhin ein Seitenmenü angezeigt wird. Wählen Sie im Seitenmenü „global“.

Dadurch wird ein Bildschirm angezeigt, auf dem mehrere Eingabefelder und Kontrollkästchen bereits auf Standardparameter voreingestellt sind. Ändern Sie gegebenenfalls die Auswahl, um das zu faltende Peptid festzulegen. Passen Sie die Länge und Genauigkeit der Simulation an, indem Sie die Anzahl der globalen Schritte bzw. die Anzahl der Aufrufe lokaler Minima anpassen.

Wählen Sie „Alle“ für die Faltung aller Atome des Peptids aus. Dann wählen Sie „Film speichern“, um eine Filmdatei der Faltung zu erstellen. Klicken Sie abschließend auf „Anwenden“, um die Faltung im grafischen Fenster zu starten.

Der Algorithmus beginnt, das Peptid in verschiedene Konformationen zu falten, wobei er für jede Konformation die Peptidenergie berechnet und aufzeichnet. Nach Abschluss werden die energetisch stabilste Konformation des Peptids sowie alternative Konformationen mit nahezu gleicher Energie identifiziert und am Computer visualisiert. Durchführung der Peptid-Faltung. Die Verwendung der Benutzeroberfläche veranschaulicht, wie die Faltung aussieht, ermöglicht jedoch nicht die ideale Parameterauswahl für die Faltung der V-drei-Schleifen-Krone.

Zu diesem Zweck ist es am besten, das Faltungsverfahren über die nichtgrafische Kommandozeile mithilfe eines Skripts durchzuführen. Ein Skript ist einfach eine Reihe von Textbefehlen, die zeilenweise in eine Datei oder Textdatei gespeichert werden und anschließend automatisch in das ICM-Programm eingegeben und nacheinander ausgeführt werden, um die V-drei-Schleife mithilfe einer Befehlsskriptreihe zu falten. Zunächst muss eine Textdatei erstellt und auf der Festplatte des Computers in einem lokalen Verzeichnis gespeichert werden. Wie zuvor beginnt man damit, das Peptid im virtuellen Raum des Computers aufzubauen.

Vergeben Sie anschließend einen Namen für die Simulation und legen Sie die Anzahl der freien Variablen fest, bei denen es sich um die chemischen Bindungen im Peptid handelt, die während der Faltung frei rotieren können. Geben Sie danach die Dauer der Simulation zur optimalen Faltung der V-drei-Schleife an. Diese hängt von der Anzahl der im vorherigen Schritt identifizierten freien Variablen ab, um die Präzision der konformationellen Suche im Experiment festzulegen; setzen Sie die Anzahl der Suchschritte, die in jedem lokalen Minimum durchgeführt werden sollen.

Danach andere Parameter festlegen, die basierend auf vorheriger Forschung für die Simulation optimiert wurden, einschließlich der Temperaturminimierung, des Gradienten und der Wahrscheinlichkeitsverteilung. Nach der Festlegung der experimentellen Parameter angeben, welche Energieberechnungen während des Faltens verwendet werden sollen. Hier wird die Van-der-Waals-Energie durch VW interne Peptide angegeben.

Energie wird durch 14 Wasserstoffbrückenbindungsenergie angegeben, die durch HB elektrostatisch angezeigt wird. Energie wird durch El Salvation angegeben. Energie wird durch SF bezeichnet und Entropie wird durch EN bezeichnet. Geben Sie die endgültigen Einstellungen an, einschließlich der bevorzugten Rückgrat- und Seitenkettenwinkel, die durchsucht werden sollen, sowie der Ausgangskonformation.

Notieren Sie abschließend den Befehl zum Ausführen und Speichern der Berechnung. Sobald das Skript als Textdatei geschrieben und gespeichert wurde, führen Sie es über die Befehlszeilenschnittstelle des Computers aus. Wie zuvor werden die energetisch stabilste Konformation des Peptids sowie alternative Konformationen mit vergleichbarer Energie identifiziert und in der Projektdatei zur Visualisierung am Computer gespeichert.

Nach Abschluss der Berechnung die Datei öffnen, indem im EE-Auswahlmenü „Datei öffnen“ ausgewählt wird. Das Molekül anzeigen, indem im Arbeitsbereichsfenster das Kontrollkästchen daneben aktiviert wird, dann die Ansicht „Molekularmechanik-Stapel“ auswählen. Um den energetisch ranggeordneten Stapel der besten Peptidkonformationen aus dem Faltvorgang anzuzeigen, im unteren rechten Bereich des Stapelfensters auf das Diagrammwerkzeug klicken, um die Ergebnisse darzustellen.

Klicken Sie zuerst im erscheinenden Fenster auf „Okay“ und anschließend auf den mittleren Reiter der Grafik, der als „best confo“ bezeichnet ist. Danach klicken Sie auf die erste Zeile der Ergebnis-Stack-Tabelle, also die Konformation mit der niedrigsten Energie, die bei der Suche gefunden wurde. Die Peptidstruktur ordnet sich in der grafischen Ansicht entsprechend ihrer energetisch günstigsten Konformation neu an.

Analysieren Sie diese Bestätigung hinsichtlich beta-faltblattartiger oder alpha-helikaler Eigenschaften, insbesondere in den ersten fünf Positionen des Peptids. Wählen Sie dazu diesen Bereich in der Sequenz aus und klicken Sie auf das Stab-Symbol in der linken oberen Ecke des Bildschirms, um alle Atome anzuzeigen. Anschließend müssen die Stapelergebnisse der Energie analysiert werden, um die besten Bestätigungen grafisch darzustellen.

Wenn die energetisch günstigste Konformation durch eine signifikante Lücke von den anderen Konformationen getrennt ist, deutet dies auf eine Tendenz zu einer starren Struktur hin. Um die Ergebnisse zu bewerten, öffnen Sie das Projektgefäß und wählen Sie die Ansicht „Molekularmechanik-Stapel“. Eine Tabelle der Stapelkonformationen wird angezeigt. Visualisieren Sie die Stapelkonformationen, indem Sie auf das Histogramm-Symbol klicken.

Klicken Sie abschließend auf „Molekularmechanik-Stack abspielen“, um einen Film im Stack zu erstellen und die durch die Faltung hier aufgedeckten konformationellen Präferenzen zu visualisieren. Die Ergebnisse für die Faltung von R zwei werden gezeigt. Die Konformation ist nicht alpha-helikal und stellt eine zufällige Wicklung dar, wie für V-drei-Schleifenkronen erwartet, insbesondere im Fragment von Aminosäureposition 12 bis 14.

Im V-drei-Loop ist im gesamten Stapel eine klare Präferenz für die beta-Faltblatt-Konformation erkennbar, während nur sehr wenige alpha-helikale Konformationen beobachtet werden. Eine lokale beta-Faltblatt-Konformation wird an ihrer ausgedehnten linearen Form erkannt. Hier befindet sich die ungewöhnliche Isoleucin-Prolin-Methionin-Sequenz des R-zwei-Stamms, eine seltene Sequenz in HIV-Stämmen an dieser Position, von der vermutet wird, dass sie für die ungewöhnlichen Eigenschaften von R zwei verantwortlich ist.

Außerdem ist ein energetischer Abstand von fast drei Einheiten zwischen der energetisch günstigsten Konformation und der zweitniedrigsten energetischen Konformation erkennbar. Daher verlässt die Struktur die energetisch günstigste Konformation weniger als 1 % der Zeit, was darauf hindeutet, dass die R-2-V-3-Krone und ihre lokale Beta-Spannungskonformation an den Positionen 12 bis 14 eine starrere Struktur aufweist, anstatt vollständig flexibel zu sein. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine V-3-Schleifenkrone-Sequenz mithilfe des Ab-Initio-Algorithmus in der ICM-Software faltet, und wie man die Ergebnisse unter Verwendung des R-2-Stamms des HIV-Virus analysiert.

Als Beispiel: Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Identität des faltenden Peptids, das einem Fragment der V-Drei-Krone entspricht, sorgfältig auszuwählen, und ebenso wichtig ist es, die Ergebnisse unter Berücksichtigung der konformationellen Präferenz und Energie mithilfe von Expertenrats eines Molekularmodellierers zu interpretieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.