Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, durch Medikamente hervorgerufene Veränderungen in den Eigenschaften einer Doppelschicht zu messen, wie sie von doppelschichtüberspannenden Proteinen wahrgenommen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Fluor-beladene, große einseitige SLES hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Vesikel mit Gramin zu dotieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen externen Löscher hinzuzufügen und die Abklingrate des internen Fluorophors zu messen. Vier. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Quantifizierung der Änderung der Fluoreszenzlöschung pro Gramm Aktivität, indem eine gestreckte Exponentialfunktion an den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz angepasst wird. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, um zu bewerten, ob Amfi-Dateien die Eigenschaften von Lipiddoppelschichten verändern können.

Hallo, ich bin Ola Anderson. Hallo, ich bin Helson. Hi, ich bin Richie Kapo.

Und ich bin Leah Sanford aus dem Labor von Dr. Olaf Anderson an der Abteilung für Physiologie und Biophysik am Weill Cornell Medical College. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung von Veränderungen in den Eigenschaften von Lipid-Doppelschichten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Wirkungen von Arzneimitteln und kleinen Molekülen auf die Eigenschaften von Lipid-Doppelschichten zu untersuchen.

Beginnen wir mit Tag eins dieses Verfahrens: Entnehmen Sie das Lipid aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur temperieren. Sobald es temperiert ist, geben Sie 0,6 Milliliter einer Lösung aus 25 Milligramm pro Milliliter Lipid in Chloroform in einen 25-Milliliter-Rundkolben. Anschließend wird die Lösung unter Stickstoffgas getrocknet, während der Kolben kontinuierlich rotiert wird, bis das gesamte Chloroform verdampft ist.

Und ein dünner weißer Lipidfilm überzieht die gesamte untere Hälfte des Kolbens; trocknen Sie das Lipid zusätzlich über Nacht im Vakuumexsikkator. Bereiten Sie eine Lösung aus 100 Millimolar Natriumnitrat, 25 Millimolar A NTS und 10 Millimolar HEPs mit einem pH-Wert von sieben vor. Vermeiden Sie beim Einstellen des pH-Werts dieser Lösung chloridhaltige Lösungsmittel.

Da das Thallium-Quencher am zweiten Tag einen unlöslichen Komplex mit dem Chlorid bildet, hydratisieren Sie die Lipide in 1,67 ml dieser Elektrolytlösung, um eine 10 Millimolar-Lipid-Suspension zu erhalten. Sobald die korrekte Konzentration erreicht ist, verschließen Sie die Probe mit Parafilm, wirbeln Sie die Suspension gründlich durch Vortexen, schützen Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur altern.

Am dritten Tag die Mischung eine Minute lang in einem Niedrigleistungs-Ultraschallbad beschallen. Anschließend den Probenbehälter fünf Minuten lang auf Trockeneis einfrieren und danach fünf Minuten in warmem Wasser auftauen; wiederholen Sie diesen Einfrier-Auftau-Zyklus vier bis fünfmal. Extrudieren Sie die Lipid-Suspension mithilfe eines Avanti-Mini-Extruders.

Richten Sie den Mini-Extruder mit einem 0,1-Mikron-Polycarbonatfilter und Filterstützen ein, und extrudieren Sie die Suspension 21-mal hin und her, bis eine nahezu durchscheinende Suspension in der gegenüberliegenden Spritze vorliegt, wodurch eine Suspension großer unilameller Vesikel (LUVs) entsteht. Entfernen Sie äußere ANTS, indem Sie die extrudierte Suspension über eine PD-10-Säule laufen lassen, die mit Natriumpuffer equilibriert wurde. Geben Sie 1,5 Milliliter der LUV-Suspension zusammen mit einem Milliliter Natriumpuffer auf die Säule.

Nachdem die Lösung vollständig in die Säule eingetragen wurde, eluiere die Liposomen mit drei Milliliter Natriumpuffer und sammle das Eluat. Die resultierende A NTS-gefüllte LUV-Stammlösung sollte etwa vier bis fünf Millimolar Lipid enthalten und durchscheinend erscheinen. Milchig weiß.

Schützen Sie die Lösung vor Licht mit Folie und lagern Sie sie bei 13 Grad Celsius 24 Stunden vor Gebrauch gründlich verwirbeln. Die mit A NTS gefüllte LUV-Stammlösung. Da UUVs eine Dichte größer als ein Gramm pro Milliliter und/oder Sediment aufweisen.

Anschließend verdünnen Sie die mit A-NTS gefüllte LUV-Stammlösung 1:20 mit Natriumpuffer. Inkubieren Sie drei Viertel der Liposomen mit 260 Nanogramm Abidin in DMSO. Geben Sie zum verbleibenden Viertel das gleiche Volumen DMSO ohne Gramin hinzu.

Um die Lösungsmittelkonzentration in allen Proben konstant zu halten, lassen Sie das Gramin 24 Stunden lang bei 13 Grad Celsius zwischen den inneren und äußeren Monolagen der Lipidvesikel equilibrieren. Hier wird ein photophysikalisches SX-Point-20-Stopped-Flow-Spektrofluorimeter mit Temperaturkontrolle verwendet, um die Rate der Fluoreszenzlöschung zu messen. Schalten Sie die Geräte zur Vorbereitung eine Stunde im Voraus ein, um eine ausreichende Aufwärmzeit zu gewährleisten.

Der Spalt mit Rapporteur für die Anregung sollte eins zu eins betragen, und ein Hochpassfilter mit 455 Nanometer sollte für die Aufzeichnung der Emission unter Verwendung der Pro-Data-SX-Software verwendet werden. Richten Sie zuerst die Aufnahmebedingungen ein und stellen Sie die Anregungs-Wellenlängen des Monochromators auf 352 Nanometer ein. Verwenden Sie die Druckhaltefunktion.

Stellen Sie die Zeit auf eine Sekunde und die Punkte auf 5.000 ein. Passen Sie die Anzahl der Wiederholungen auf neun für Pufferläufe und auf 13 für Quencher-Läufe an. Überwachen Sie die Temperatur im Essex-Software-Prüffahrprofil.

Das Treibervolumen sollte auf 120 Mikroliter eingestellt werden, wodurch jeweils 60 Mikroliter aus jeder Spritze gemischt werden. Dies ergibt eine Totzeit von etwa 1,2 Millisekunden. Stellen Sie die Hochspannung oder den Verstärkungsfaktor des Fluoreszenzdetektors auf etwa 420 Volt ein.

Das Ziel besteht darin, eine Fluoreszenzmessung von etwa acht zu erhalten. Äquilibrieren Sie die zuvor hergestellten, mit A NTS beladenen UUVs 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Vortexen Sie die Probe nach der Äquilibrierung und geben Sie sie anschließend in die linke Spritze. In die rechte Spritze geben Sie entweder Natriumpuffer oder Thallium.Quencher.

Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Spritzen hin und her bewegen. Beide Spritzen sollten gleichmäßig befüllt sein. Bevor die Ventile für die erste Probe geschlossen werden, nehmen Sie die Fluoreszenz mit Natriumpuffer auf.

Wiederholen Sie den Vorgang viermal und stellen Sie bei Bedarf die Verstärkung entsprechend ein. Wiederholen Sie anschließend fünf weitere Male für die verbleibenden Proben. Nehmen Sie neun Wiederholungen mit Natriumpuffer auf.

Ersetzen Sie den Natriumpuffer durch den Thallium-Quencher und nehmen Sie 13 Wiederholungen auf. Spülen Sie mit Wasser und fahren Sie mit den nächsten Probenkontrollen fort. Fügen Sie Proben ohne Gramin und mit Lösungsmittel sowie ohne Gramin und mit der maximalen Verbindungskonzentration ein.

Und mit sowohl Gramin als auch Lösungsmittel, die der Fluoreszenzanalyse folgen, lesen Sie die Daten zur Auswertung in die MATLAB-Software ein. Bei jeder Probe, bei der alle Puffer- und Quencher-Wiederholungen ausgewertet werden, sind die ersten vier Wiederholungen durch das zuvor in der Tubing vorhandene Material kontaminiert. In diesem Fall resultiert das Signal aus der Vermischung der Natriumpufferprobe mit Wasser aus der vorherigen Spülung.

Die Wiederholungen fünf bis neun stellen das Signal allein aus der Probe dar. Daher schließen wir in jedem Fall die ersten vier Wiederholungen aus. Um Störungen durch Mischartefakte zu vermeiden, gehen Sie manuell die Kurven durch und entfernen Sie alle fehlerhaften Wiederholungen, wie beispielsweise die rote Kurve, die Spikes oder Abweichungen aufgrund von Mischartefakten oder Blasen enthält.

Danach normalisieren Sie die Quencher-Wiederholungen auf den durchschnittlichen Startwert der Puffer-Wiederholungen für jede Probe unter jeder experimentellen Bedingung, kombinieren die Mittelwerte aller Proben in einem einzigen Diagramm. Visualisierungsproben ohne Gramin sollten alle ähnlich sein und nahezu keine Fluoreszenzlöschung zeigen. Bei Proben mit Gramsidin tritt eine langsame Abnahme des Fluoreszenzsignals auf, verursacht durch das langsame Eindringen von Thalliumionen in die Vesikel. Falls der fluoreszierende Zeitverlauf durch die Verbindung sichtbar verändert wird, beeinflusst die Verbindung die Eigenschaften der Lipiddoppelschicht bei der getesteten Konzentration; passen Sie anschließend eine gestreckte Exponentialfunktion an die ersten zwei bis 100 Millisekunden der normalisierten Fluoreszenzlöschungskurven an.

Führen Sie die einzelnen Wiederholungen durch und berechnen Sie die Rate bei zwei Millisekunden. Berechnen Sie anschließend die Mittelwerte und Standardabweichungen für eine gegebene Probe aus den einzelnen Wiederholungen. Der hier als cap bezeichnete Effekt von Capsaicin wurde am zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzlöschung in Abwesenheit oder Gegenwart von Gramin – hier als ga gekennzeichnet – beobachtet. Das normalisierte Fluoreszenzsignal ist hier über eine Sekunde dargestellt. Graue Punkte repräsentieren die Ergebnisse aller Wiederholungen, während die roten Linien die Mittelwerte darstellen.

Die ersten 100 Millisekunden des normalisierten Fluoreszenzsignals sind dargestellt. Graue Punkte zeigen Ergebnisse einer einzelnen Wiederholung für jede Bedingung. Rote Linien sind gestreckte exponentielle Anpassungen an diese Wiederholungen.

Die unterdrückte blaue Linie kennzeichnet den Zeitpunkt von zwei Millisekunden. Der Zeitpunkt, zu dem die Quenchgeschwindigkeit bestimmt wird. Die relative Änderung der Quenchrate wird durch Normierung der Daten auf die Kontrollprobe mit Gramin und ohne Modifikator ermittelt.

Wenn Capsaicin in die Lipiddoppelschicht eindringt, verändert es die Eigenschaften der Doppelschicht. Die Veränderung hin zu einer weicheren Doppelschicht spiegelt sich in einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Monomer und Dimer zugunsten des leitfähigen Dimers wider. Soeben haben wir Ihnen ein Verfahren gezeigt, um die störenden Effekte eines kleinen Moleküls auf die Lipiddoppelschicht zu messen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets die geeigneten Kontrollen für jedes Experiment unter Verwendung derselben Vesikelcharge einzuplanen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.