Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Transgene Mäuse für antigenspezifische T-Zell-Rezeptoren waren unverzichtbar bei der Untersuchung der T-Zell-Entwicklung und -Funktion, um Mausmodelle mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor-Spezifitäten unter Verwendung der somatischen Zellkerntransfer- oder SCNT-Technik zu erzeugen. Eine Maus wird mit einem interessierenden Pathogen infiziert. T-Zellen werden aus der Maus isoliert und anschließend durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gereinigt.

Die gereinigten T-Zellen werden anschließend für die somatische Zellkernübertragung verwendet. Nachdem die Embryonen das Blastozystenstadium erreicht haben, werden embryonale Stammzellen isoliert. Diese Zellen werden dann in Blastozysten injiziert, die anschließend in pseudoschwangere Mäuse transferiert werden.

Die resultierenden Welpen weisen eine deutliche Zunahme der Population der interessierenden T-Zellen auf, was durch eine PAX-Analyse validiert werden kann. Hallo, mein Name ist Okta AK und ich bin Postdoktorand am White Institute for Biomedical Research. Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man somatische CLE-Transfer-Blastocysten-Injektionen sowie Embryotransfers durchführt.

Der Hauptvorteil der somatischen Übertragung besteht darin, dass Mausmodelle erzeugt werden können, die ihren T-Zell-Rezeptor vom endogenen Locus exprimieren und somit unter Kontrolle des endogenen Promotors stehen, und dass solche Mausmodelle sehr schnell generiert werden können. Die somatische Flüssigübertragung kann als Werkzeug zur Erzeugung von Mausmodellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor- oder B-Zell-Rezeptor-Spezifitäten verwendet werden. Dies ist besonders interessant für Personen, die in Bereichen wie Autoimmunität, Infektionskrankheiten und Krebs forschen.

Um T-Zellen zu isolieren, die spezifisch für einen Erreger wie Toxoplasma gondii sind, wird eine infizierte Maus am Höhepunkt der Immunantwort durch intraperitoneale Injektion euthanasiert, die Milz wird aus der euthanasierten Maus gewonnen, die Zellen werden homogenisiert, und die Spenderzellen werden anschließend mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und dem entsprechenden Tetramer inkubiert. Abschließend erfolgt eine FACS-Analyse, um erregerspezifische T-Zellen zu erhalten. Am Abend vor dem Enukleationsverfahren der Oozyten.

Stellen Sie vier, fünf und sieben Mikrometer lange Piso-Injektionsnadeln her und laden Sie diese rückwärts mit Quecksilber, indem Sie eine Spritze verwenden. Am nächsten Tag beginnen Sie das Verfahren der somatischen Zellkerntransfer, indem Sie Oozyten sammeln und sie anschließend mit einer Mundpipette in Tropfen des K-S-O-M-A-A-Mediums in einer Petrischale überführen. Im Deckel der Petrischale.

Bereiten Sie eine Platte zur Durchführung der somatischen Zellkerntransfer- oder SCNT-Technik vor, indem Sie etwa 10 Tropfen PVP, etwa 10 Tropfen HCZB mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Cyto B und etwa 10 Tropfen HCCB mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Cyto B hinzufügen. Diese Platte wird als S-C-N-T-A-Platte bezeichnet. Stellen Sie die S-C-N-T-A-Platte auf den Objekttisch eines umgekehrten zusammengesetzten Mikroskops.

Platzieren Sie anschließend eine sieben Mikrometer große Enukleationsnadel in den Mikromanipulator und spülen Sie sie, indem Sie fünf bis zehn Mal Polyvinylpyrrolidon-Lösung aufziehen und verwerfen. Überführen Sie dann 10 bis 30 in Metaphase zwei arretierte Zellen aus der Petrischale in einen der Tropfen mit HCCB mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Cyto B auf der S-C-N-T-A-Platte und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Während der Inkubation richten Sie die Oozyten horizontal aus.

Nachdem fünf Minuten vergangen sind, verwenden Sie die Enukleationsnadel, um ein Oozyt vor die Haltendenadel zu bringen. Mit einem Mikroinjektor erzeugen Sie ein Vakuum, um das Oozyt an der Mikropipetten-Haltendenadel zu fixieren.

Danach die Oozyte mithilfe der Enukleationsnadel drehen, bis der Chromosomen-Spindelkomplex, der im Vergleich zum opaken Plasma hypertransparent erscheint, in der Drei-Uhr-Position steht. Ein Piezo-Impuls wird durch Betätigen des Pedals ausgelöst, um die Zona pellucida zu durchdringen. Ein Piezo-Impuls ist ein mechanischer Impuls, der sich longitudinal ausbreitet und die Spitze der Enukleationsnadel in Schwingung versetzt. Die Vibrationen der Nadelspitze erleichtern das Bohren durch die Zona pellucida.

Nachdem die Zona pellucida durchdrungen ist, platzieren Sie die Öffnung der Nukleationsnadel neben dem Spindelapparat der Metaphase II und legen Sie Vakuum an. Der Chromosomen-Spindel-Komplex bewegt sich langsam in die Nadel hinein. Sobald die Nadel entfernt ist, sollte sich die Membran von selbst verschließen.

Überführen Sie schließlich mithilfe einer Mundpipette die enukleierten Zellen zurück in die K-S-O-M-A-A-Tropfen. Waschen Sie sie anschließend, indem Sie sie mit derselben Pipette von Tropfen zu Tropfen von KSOM AA transferieren, um den nuklearen Transfer durchzuführen. Ersetzen Sie die sieben Mikrometer durchmessende Enukleationsnadel am Mikromanipulator durch eine vier bis fünf Mikrometer durchmessende Nukleartransfernadel. Waschen Sie die Nadel wie zuvor mit PVP.

Platzieren Sie die zuvor isolierten CD8-positiven T-Zellen in einen Tropfen PVP auf der S-C-N-D-A-Platte. Gut mischen und mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Überführen Sie anschließend 10 bis 30 entkernte Zellen in einen Tropfen HCZB mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter.

Cyto B auf der S ct.-Platte fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Inkubation die Zytomeren mit der Nukleustransfer-Nadel mithilfe der Injektionsnadel horizontal ausrichten.

Ein donorfähiges CD8-positives Zell aus dem PVP-Medium aufnehmen und mehrmals ein- und auspipettieren, bis die äußere Membran aufgebrochen ist. Gegebenenfalls einen Piezo-Impuls anwenden; Fragmente der Membran und des Cytosols sollten sichtbar sein. Den Zellkern in die Pipettenspitze aufsaugen.

Danach weiterhin Zellkerne aufnehmen, bis 10 bis 30 vorhanden sind. Anschließend zur Tropfen wechseln, der die ausgerichteten entkernten Zellen enthält. Das Vakuum anlegen, um eine Oozyte an der Halbenadel zu fixieren.

Danach platzieren Sie die NU-Nukleus-Transfernadel neben der Zop-Lucita, wobei die Kerne von der Öffnung weg orientiert sind. Geben Sie einen Piezo-Impuls ab, bis die Nadel durch die Zop-Lucita gedrungen ist. Bewegen Sie mithilfe des Mikromanipulators vorsichtig einen Kern an die Nadelspitze.

Stechen Sie die Nadel in die Oozyte, bis sich die Nadelspitze zu zwei Dritteln im Inneren befindet. Erzeugen Sie einen geringen Unterdruck, sodass sich ein kleiner Teil der Oozytenmembran in der Nadel befindet. Der nächste Schritt ist sehr kritisch.

Da dies der einzige Zeitpunkt ist, zu dem die Oozyte tatsächlich geöffnet ist. Geben Sie einen einzelnen ZO-Impuls ab. Anschließend wenden Sie positiven Druck an, um den Zellkern aus der Nadel herauszudrücken.

Ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück, sodass sich die Spitze etwa ein Drittel in die Oozyte hineinbefindet, und erzeugen Sie anschließend Unterdruck, während Sie die Nadel weiter zurückziehen. Um die Oozyte abzudichten. Wiederholen Sie diesen Schritt mit jeder Oozyte.

Nachdem alle Oozyten einen Zellkern erhalten haben, überführen Sie sie in die Petrischale und waschen Sie sie, indem Sie sie von Tropfen zu Tropfen des KS OM AA-Mediums transferieren. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten. Nach der Inkubation überführen Sie die SCN-T-Embryonen in Tropfen eines kalziumfreien Aktivierungsmediums, das Strontiumchlorid enthält. Strontiumchlorid aktiviert das Oozyt, indem es Kalziumoszillationen induziert, die ähnlich wie während der Befruchtung auftreten würden.

Sechs Stunden inkubieren. Falls gewünscht, TSA, einen unspezifischen Inhibitor der histonenden Diacetylasen, dem Aktivierungsmedium hinzufügen, um die Effizienz nach der Aktivierung zu verbessern. Untersuchen Sie die Embryonen unter dem inversen Mikroskop, um die Anzahl der Pseudopronuklei oder PPN-positiven SCNT-Embryonen zu bestimmen. Die PPN können anhand ihres Erscheinungsbildes identifiziert werden.

Sie sehen aus wie Eier. Spülen und kultivieren Sie sie mit der „Sunny-side-up“-Methode. Die Embryonen und K-S-O-M-A-A-Tropfen werden für dreieinhalb Tage bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis sie das Blastozystenstadium erreicht haben.

Am Anfang sollten Sie darauf achten, die Verfahren, die wir Ihnen soeben zur Keimbildung und zum nuklearen Transfer in den NU-Zellen gezeigt haben, korrekt durchzuführen. Sobald Sie diese Techniken beherrschen, lassen sich die folgenden Verfahren leichter bewältigen. Die hier verwendeten embryonalen Stammzellen oder ES-Zellen wurden mit Standardmethoden gewonnen.

Diese sollten am Tag der blastunterstützten Injektion, dreieinhalb Tage nach dem Koitus, vorbereitet werden. Bereiten Sie den Deckel einer sterilen Bakterienschale vor, indem Sie Tropfen, die PVP und HCZP enthalten, auftragen. Bereiten Sie anschließend eine 15-Mikrometer-Injektionsnadel für den Piso-Puls wie zuvor beschrieben vor.

Als Nächstes platzieren Sie die Injektionsnadel im Mikromanipulator und spülen sie mit PVP-Transfer. Führen Sie 10 bis 30 Blast-Unterstützungen in einen Tropfen HCZB durch. Anschließend geben Sie fünf bis 50 Mikroliter der ESL-Suspension in einen weiteren Tropfen HCZB.

Es sollten genügend ES-Zellen vorhanden sein, damit sie leicht aufgenommen werden können, sie dürfen jedoch nicht zu dicht beieinander liegen. Danach 30 bis 100 ES-Zellen mit der Injektionsnadel aufnehmen. Zur Tropfen mit dem Blast-Assist bewegen.

Richten Sie die Blastozystenhilfe horizontal aus und befestigen Sie sie mit der Halbenadel, indem Sie Vakuum anlegen. Drehen Sie die Blastozystenhilfe mit der Injektionsnadel, bis die innere Zellmasse auf neun Uhr steht. Positionieren Sie die Injektionsnadel auf drei Uhr.

Stellen Sie sicher, dass sich keine ES-Zellen an der Nadelspitze befinden, und geben Sie einen Piso-Puls ab, bis die Injektionsnadel durch die Zop-Lucita und die Trifecta in das Blastische Siegel eindringt. Setzen Sie fünf bis 15 ES-Zellen frei, damit sie an der innere Zellmasse haften. Setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Blast-Assists nach Abschluss der Injektionen injiziert wurden.

Zweimal in K-S-O-M-A-A waschen und anschließend zum chirurgischen Embryotransfer in pseudo-gravide Weibchen fortfahren; das anästhesierte pseudo-gravide weibliche Empfängermäuschen im Operationsbereich platzieren. Mit einem elektrischen Rasierer die Haare aus dem rechten unteren Quadranten entfernen. Den Bereich unter einem Stereomikroskop mit einer jodhaltigen Lösung und 70 %igem Ethanol desinfizieren.

Öffnen Sie die Haut mit einer Schere und legen Sie dann die geschlossene Schere zwischen Haut und Peritoneum. Öffnen Sie die Schere, um das Peritoneum von der Haut zu lösen. Lokalisieren Sie den Eierstock durch das Peritoneum, der als roter Fleck sichtbar sein sollte. Öffnen Sie anschließend mit der Schere das Peritoneum in diesem Bereich.

Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig den UCT oder das umgebende Fettgewebe zu greifen, und ziehen Sie die Gebärmutter mit einer an eine Mundpipette angeschlossenen Kapillare heraus. Nehmen Sie eine Gruppe von etwa 10 Blastozysten auf, wobei Sie den Eileiter und die Gebärmutter mit der Pinzette festhalten. Verwenden Sie eine Nadel, um ein kleines Loch in die Gebärmutter zu stechen.

Danach die Kapillare mit der Blastunterstützung in das Lumen der Gebärmutter einführen und die Embryonen freisetzen. Die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle schieben. Die Ränder des Peritoneums lokalisieren und mit einigen Stichen verschließen.

Schließen Sie die Haut des Mäuses mit einigen Klammern. Verabreichen Sie Schmerzmittel subkutan. Anschließend bringen Sie die Maus unter einer Wärmelampe in ihren Käfig zurück.

Überwachen Sie die Atmung der Maus, bis sie aufwacht. Nach Enukleation und somatischer Zellkerntransfer. Etwa 70 % der Embryonen waren positiv für Pseudopronuklei.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, hatte die Behandlung mit TSA entweder sechs oder zehn Stunden lang keinen Effekt. Nach dreieinhalb Tagen in Kultur entwickelten sich fünf bis zehn % der Embryonen zu Blastozysten.

Auch hier hatte die Zugabe von TSA keinen Einfluss auf die Rate der Entwicklung von Blastozysten-assistierten Embryonen. Die SCNT-Blastozysten-assistierten Embryonen wurden anschließend zur Ableitung embryonaler Stammzellen verwendet. TSA verbesserte signifikant die Rate, mit der ESL-Zellen aus blastozysten-assistierten Embryonen abgeleitet wurden.

Die S-C-N-T-E-S-Zellen werden zur Erzeugung chimärer Mäuse verwendet. Aus diesen Mäusen wird Blut entnommen und mittels FACS-Analyse auf das Vorhandensein spezifischer T-Zellen untersucht, wie hier gezeigt. Wenn das Blut mit einem Anti-CD4-Antikörper und einem spezifischen Tetramer gefärbt wird, kann eine doppelt positive Population identifiziert werden.

Was darauf hinweist, dass die für die SCNT verwendete Donorzelle die korrekte Spezifität aufwies. Ich habe Ihnen soeben gezeigt, wie man eine somatische Zell-LU-Übertragung, Blastomere-Injektionen und eine Embryotransfer durchführt. Der wichtigste zu berücksichtigende Punkt ist die Reinheit Ihrer T-Zellen oder B-Zellen.

Nachdem Sie gelernt haben, wie man eine somatische Zellkernübertragung durchführt und Ihre Embryonen entweder das Blastozystenstadium erreicht haben, können Sie wählen, ob Sie sie direkt in pseudoschwangere Weibchen transferieren oder ob Sie sie zur Ableitung embryonaler Stammzellen verwenden und daraus chimäre Mäuse erzeugen.