Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

Hallo, ich bin Raja Ti und absolviere meine Promotion am Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Ich werde Sie durch die Schritte führen, die bei der 3D-Darstellung der Eastern-Modifikation beteiligt sind, die DNA-Schäden und chromatische Kondensation in einer neuen Herzzelle markiert. Die DNA ist um nukleäre Zonen gewickelt.

Jedes Nukleosom besteht aus vier verschiedenen Arten von Histonen: H2A, H2B, H3 und H4. Die Bildung von DNA-Strangbrüchen wird durch die Phosphorylierung von H2AX markiert. Diese Phosphorylierung von H2AX erfolgt hauptsächlich in Bereichen, die als H3K4-Methylierung gekennzeichnet sind. Nun betrachten wir die dreidimensionale Darstellung von Modifikationen in Ihrer Zelle, immunmarkiert mit dem phosphorylierten H2AX und dem methylierten H3K4.

Beginnen wir. Wir geben die E-Kurve der Zellsuspension in 15 ml Falcon-Röhrchen und waschen sie zweimal mit PB-Zentrifugation bei 150 × g und Resuspension.

In frischem Medium resuspendieren, um die unmittelbare Wirkung der Strahlung auf zelluläre Vorgänge zu beobachten. Die Zellen vor und während der Bestrahlung fünf bis zehn Minuten lang im Auge behalten. Die Zellen entweder Gammastrahlung oder Röntgenstrahlen aussetzen. Nach der Bestrahlung je drei Milliliter der Zellsuspension in jedes der sechs GU abgeben.

Mikrotiterplatte für peak gamma H2AX: Inkubieren Sie die Zellen zwischen 30 Minuten und einer Stunde bei 37 °C. Wir verwenden die Cytosin-Mission, um die nicht-anklebenden Zellen auf Objektträger aufzubringen. Achten Sie beim Zusammenbau des Cytosin-Clips darauf, dass die gesamte Filtermembran mit dem Trichter übereinstimmt.

Geben Sie jeweils 50 Mikroliter aus, bepinseln Sie diese Zellsuspension in jede Cytosin-Endposition, setzen Sie die Cytosin-Clips in die Cytosin-Mission ein und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang mit 500 U/min. Entfernen Sie die Cytosin-Clips und trennen Sie die Objektträger von der Filterkarte. Lassen Sie die Zellen nicht zu lange an der Luft trocknen, da dies den Hintergrund bei der Fluorescein-Färbung beeinflussen könnte.

Unter Verwendung einer flüssigkeitsblockierenden Stiftspitze zeichnen Sie Kreise um jeden Abstrich und fixieren die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Im Vergleich zu Ethanol oder Öl wurde eine bessere Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd beobachtet. Danach permeabilisieren Sie die Objektträger mit PBS und Triton X-100 bei Raumtemperatur für fünf Minuten.

Im Vergleich zu Twin 80 zeigten die Zellen mit Triton X 100 ein besseres Signal. Beobachten Sie die Zellen mit PP dreimal jeweils fünf Minuten lang. Blockieren Sie die Zellen mit BSA für 10 Minuten bei Raumtemperatur und wiederholen Sie dies dreimal im Vergleich zu anderen Blockiermitteln und Inkubationszeiten.

BSA war am effizientesten bei der Minimierung der unspezifischen Bindung von primären Antikörpern. Wir haben zwei primäre Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:500 mit 1 % BSA verwendet, wobei etwa 50 µL primärer Antikörper pro Objektträger aufgetragen wurden. Eine Inkubation des primären Antikörpers bei Raumtemperatur für 60 Minuten verringert im Vergleich zur Übernachtinkubation bei vier Grad Celsius die Hintergrundanfärbung. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS je fünf Minuten lang.

Alexa Boden 4 88, gute Anti-Maus und Alexa Boden 5 46 Wort Anti-Kaninchen. Sekundäre Antikörper wurden verwendet, um verschiedene Marker gleichzeitig nachzuweisen. Verwenden Sie Antikörper, die in verschiedenen Spezies erzeugt wurden.

Geben Sie etwa 50 Mikroliter verdünntes sekundäres Antikörperreagenz auf jeden Objektträger. Inkubieren Sie die Zellen 90 Minuten bei Raumtemperatur. Es wird empfohlen, die Zellen in einer feuchten Kammer zu inkubieren, um ein Austrocknen von Zellen und Antikörpern zu verhindern. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang.

50 µL einer 1:500-Verdünnung von Topo Drei in PBS wurden zu jedem Objektträger gegeben. Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit von den Objektträgern und geben Sie Antifa-Lösung hinzu.

Es wird empfohlen, die Zellen vor dem Hinzufügen der Antifa-Lösung nicht vollständig trocknen zu lassen. Legen Sie einen Deckgläser auf den Objektträger. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen entstehen.

Die Objektträger über Nacht in einer dunklen, feuchten Kammer belassen. Den Objektträger mit Nagellack versiegeln, um das Austrocknen der Zellen zu verhindern. Mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommene Bilder zeigen.

Bessere räumliche Auflösung geht verloren und ein Heliumlaser wurde für die Bildaufnahme verwendet. Ein 63er Ölimmersionsobjektiv wird gegenüber Objektiven mit höherer oder niedrigerer Vergrößerung bevorzugt. Ein Zoomfaktor von drei oder vier liefert ein Bild mit besserer Auflösung.

Für die FO-Aufnahme aus vielen Zellen ist es vorzuziehen, eine Scan-Geschwindigkeit von acht und eine Bildgröße von 1024 mal 1024 Pixelzellen zu verwenden. Bei der Aufnahme über mehrere Kanäle wird im Vergleich zum Framescan eine sequenzielle Zeilenscan-Aufnahme empfohlen. Um eine Ausbleichung der Probe zu vermeiden, werden Verstärkungsgewinnung und Verstärker-Offset so eingestellt, dass Rauschen und Signalüberlastung reduziert werden.

Da die Größe von Kama HX X vier kleiner als 0,5 Mikrometer sein kann, wird empfohlen, Bilder mit mindestens 0,5 Mikrometer Auflösung aufzunehmen. Schritthöhe entlang der Jet-Achse sind Bilder in einem Jet-Serienmuster mithilfe des Mark-first- und Mark-lost-Musters erforderlich. Um die räumliche Beziehung zwischen verschiedenen Proteinen darzustellen, wird empfohlen, eine Scan-Geschwindigkeit von sechs mit einer Bildgröße von 2048 und 248 Pixeln unter Verwendung von Metamor first zu verwenden.

Die zweite kann anhand von Bildern gezählt werden, die mit verschiedenen konfokalen Mikroskopen aufgenommen wurden. Öffnen Sie die Gamma-hgx-Bilddateien entweder direkt über das Dateimenü oder mithilfe der Rechnungsnummern. Gehen Sie zum Menü „Prozess“ und wählen Sie „Stack-Arithmetik“.

Wählen Sie die maximale Projektion aus und selektieren Sie die einzuschließenden Ebenen. Klicken Sie dann auf „Okay“. Wählen Sie nun „Top Hat“ und selektieren Sie das Gamma-H2X-Bild als Quellbild, um es anzuwenden.

Hut-Filter und resultierendes Bild ergeben ein Binärbild mit weniger Rauschen und reduzierter Variation der Fokussierung. Gehen Sie zu Bereiche und wählen Sie das Werkzeug zum Zeichnen von Bereichen aus, um Bereiche um die Kerne zu zeichnen. Gehen Sie zum Menü Prozess und wenden Sie Schwellenwert auf Bild an.

Wählen Sie die Inklusionsschwelle und legen Sie die untere und obere Schwellenwerte fest. Üblicherweise sind es die Schwellenwerte, die die vier Zahlen beeinflussen. Der optimale Schwellenwert ist derjenige, der die Hintergrundinklusion minimiert und die Foray-Inklusion maximiert.

Dies lässt sich am besten erreichen, indem man die Ausläuferanzahl unter Verwendung verschiedener Schwellenwerte zählt und anschließend die Ausläuferanzahl mit der manuellen Zählung per bloßem Auge vergleicht. Wählen Sie das DPI-Bild aus, gehen Sie zum Menü „Regionen“ und wählen Sie die Option „Regionen übertragen“.

Nun liegen entsprechende Aufnahmen des Myzelfortschritts und der Kerne zur Zählung bereit. Die meisten Kernbereiche werden auf Top-Hat übertragen. Gehen Sie zum Menü „Measure“ und wählen Sie „Integrated Morphological Analysis“ (IMA); wählen Sie „Alle Bereiche messen“ und klicken Sie auf „Measure“, um die FTE-Zahl zu erhalten.

Jetzt können die FTE-Zahlen aus jeder Region mithilfe der Option „Log-Daten“ in eine Tabellenkalkulation exportiert werden. Öffnen Sie die zuvor erstellten Jet-Projektor-Bilder für jeden Kanal. Gehen Sie zu „Anzeige“ und wählen Sie „Farbausrichtung“ aus.

Wählen Sie die jeweiligen Quellbilder für jeden Kanal aus, um ein kombiniertes Bild für alle drei Kanäle zu erstellen. Eine Linien-Scan-Analyse wird durchgeführt, um die räumliche Positionierung verschiedener Marker im Zellkern darzustellen. Gehen Sie zum Befehl der Messwerkzeugleiste und wählen Sie die Linien-Scan-Analyse, indem Sie eine Linie quer durch die Zelle ziehen.

Dadurch wird ein Diagramm erstellt, das die fluoreszierende Intensität jedes Kanals entlang der Linie anzeigt und den Abstand verschiedener Marker zueinander darstellt. Um ein 3D-Bild aus einem Stack zu erstellen, gehen Sie zum Stack-Menü und wählen Sie 3D-Rekonstruktion. Wählen Sie den 3D-Rekonstruktionstyp „Maximum“.

Wählen Sie den Rotationsplan und den Kalibrierabstand für den Jet. Normalerweise gibt der Benutzer die Angaben ein, klickt auf „Okay“ und erstellt so eine 3D-Rekonstruktion. Damit ist unser Protokoll zur Immunfluoreszenz, Färbung und Bildanalyse abgeschlossen.

Zusammenfassend ist das immunfluoreszenzbasierende konfokale Mikroskop ein Verfahren zur dreidimensionalen Darstellung verschiedener Zellmarkierungen und von Gamma-H2AX-Foci im Zellkern. Vielen Dank fürs Zuschauen.