Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kinetik des mRNA-Exportes aus dem Zellkern in Säugetierzellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst mRNA oder DNA in die Kerne von Säugetier-Zellkulturen mikroinjiziert wird. Nach der Mikroinjektion werden die Proben nach verschiedenen Inkubationszeiträumen fixiert.

Die mRNA wird anschließend mittels fluoreszenzmarkierter in-situ-Hybridisierung oder FISH gefärbt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen abzubilden und die Menge der Fluoreszenz im Zytoplasma und im Zellkern zu quantifizieren. Letztendlich kann die Rate des mRNA-Exports durch eine Kombination aus Mikroinjektion und fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung gemessen werden.

Hallo, ich bin SRG AV aus dem Labor von Alex Palazzo am Department für Biochemie der University of Toronto. Ich bin Stefan Toski, ebenfalls aus dem Palazzo-Labor. Ich bin Amy aus dem Palazzo-Labor und ich bin Khi Maha David aus dem Palazzo-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um mRNA mittels Mikroinjektion in die Kerne von Säugetierzellkulturen einzubringen. Außerdem demonstrieren wir, wie man die mRNA durch fluoreszente In-situ-Hybridisierung anfärben kann. In unserem Labor verwenden wir diese Verfahren, um die Kinetik des mRNA-Exportes aus dem Zellkern in Säugetierzellen zu untersuchen.

Beginnen wir nun. Vor der Mikroinjektion verdünnen Sie zuvor vorbereitete Plasmid-DNA auf eine Konzentration zwischen 50 und 200 Mikrogramm pro Milliliter in Injektionspuffer. Geben Sie anschließend Oregon Green 488 oder OG, konjugiert an 70 Kilodalton Dextran, zur Mischung hinzu, um die Identifizierung injizierter Zellen zu ermöglichen.

Das OG-konjugierte Dextran hilft dabei zu bestimmen, wie viel Flüssigkeit in den Zellkern injiziert wurde und wie viel in das Cytoplasma ausgetreten ist. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 G und vier Grad Celsius für mindestens 20 Minuten, um partikuläre Bestandteile, die die Nadelöffnung möglicherweise verstopfen könnten, abzutrennen. Wählen Sie die zu mikroinjizierende Säugetierzelllinie anhand der in dem schriftlichen Protokoll beschriebenen Kriterien bezüglich der Kosten aus.

Sieben Zellen werden für diesen Demonstrationskeim verwendet. Die Zellen auf sauresgewaschenen Deckgläsern in 30-Millimeter-Petri-Schalen werden mindestens 24 Stunden vor der Mikroinjektion vorbereitet. Ideal sollte die Zellmonoschicht zum Zeitpunkt der Injektion etwa 70 bis 90 % konfluent sein, um eine einfache Identifizierung der injizierten Zellen zu ermöglichen; die Zellmonoschicht wird vor der Injektion durch einen 200-Mikroliter-Kunststoffpipettenspitze verletzt.

Gravieren Sie ein Kreuz auf den Deckgläser und lassen Sie die Zellen mindestens 15 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator regenerieren, bevor die Injektion erfolgt. Verwenden Sie für die Mikroinjektion ein umgekehrtes Mikroskop, das auf einem Lufttisch isoliert ist, um Vibrationen zu minimieren, die den Mikroinjektionsprozess stören könnten. Entnehmen Sie mithilfe einer Einor-Gel-Loader-Spitze etwa ein Mikroliter von der Oberseite der Zentrifugenprobe, um zu vermeiden, dass das Pellet gestört wird.

Führen Sie die Pipettenspitze in das hintere Ende einer vorgefertigten Mikroinjektionsnadel ein und pressen Sie die Flüssigkeit heraus. Die Flüssigkeit wird durch Kapillarwirkung in die Nadelspitze aufgenommen. Innerhalb von fünf bis 30 Sekunden sollte ein Meniskus in der Nähe der Spitze sichtbar sein.

Platzieren Sie die mit Flüssigkeit gefüllte Nadel in der Halterung und befestigen Sie sie am Mikromanipulator. Unter einem Winkel von 45 Grad visualisieren Sie die Nadel mithilfe des 10x-Objektivs und positionieren Sie sie mittig im Sichtfeld nahe der Fokusebene. Über die groben Einstellknöpfe des Mikromanipulators wird die Halterung über einen Schlauch mit einer Glasspritze verbunden, die verwendet wird, um den Druck zu erzeugen, der erforderlich ist, um die Flüssigkeit aus der Nadelspitze auszustoßen.

Um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten, wird die Spritze an eine Rohrhalterung montiert. Mit zwei Gummistopfen und zwei Metallklemmen wird die Nadel einige Millimeter angehoben, um zu verhindern, dass sie in späteren Schritten beschädigt wird, und anschließend wird das Mikroskop zurückgeschoben. Säule, erhöhen Sie den Druck, indem Sie den Spritzenkolben niedrücken.

0,5 bis zwei Kubikzentimeter. Stellen Sie eine Petrischale mit einem Deckglas, das eine verletzte Zellschicht enthält, auf den Beobachtungsplatz und ziehen Sie das Mikroskop zurück.

Bewegen Sie den Hebel nach vorne in eine aufrechte Position, wodurch der Kondensor ausgerichtet wird, damit die Nadel in die Flüssigkeit eindringen kann. Dies sollte vorsichtig erfolgen, um zu verhindern, dass die Nadel am Deckglas bricht. Nutzen Sie das 10×-Objektiv, um die Mitte der gekreuzten Windung zu identifizieren, und positionieren Sie die Nadel über den Zellen, die injiziert werden sollen.

Erhöhen Sie die Vergrößerung, indem Sie zum 40x-Objektiv wechseln. Senken und zentrieren Sie dann die Nadel mit den Feinjustierschrauben am Joystick. Beginnen Sie die Injektion an einer Ecke des Wundkreuzes, indem Sie die Nadel absenken, bis sie mit dem Zellkern in Kontakt kommt.

Nach der Injektion weist eine Zelle eine deutliche Änderung der Phasenhelligkeit auf. Setzen Sie entlang einer Wundkante den Querschnitt fort. Um injizierte Zellen während der Visualisierung leicht identifizieren zu können, ist es entscheidend, dass der Injektionsdruck für jede Nadel korrekt eingestellt wird.

Der Druck muss hoch genug sein, um die Plasmamembran und die Kernmembran zu durchdringen, aber nicht so hoch, dass die Zellen abgetötet werden. Mikroinjizieren Sie Zellen entlang des Wundrands für einen festgelegten Zeitraum. Mit etwas Übung können innerhalb dieses Zeitintervalls mehrere hundert Zellen injiziert werden.

Wenn PlasmadNA injiziert wird, inkubieren Sie die mikroinjizierten Zellen vor der Fixierung 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Zellkulturinkubator und beenden Sie anschließend die Transkription. Behandeln Sie die Zellen hierzu mit einem Mikrogramm pro Milliliter Alpha-Amanitin, das in Wachstumsmedium gelöst ist. Diese Konzentration hemmt effektiv die Transkription von mikroinjizierten Plasmiden.

Stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator und lassen Sie die Zellen die neu synthetisierte mRNA exportieren. Eine einzelne Nadel kann mehrfach zum Injizieren verschiedener Deckgläser verwendet werden. Die Nadel muss jedoch ausgetauscht werden, wenn sich die Art der mikroinjizierten DNA oder RNA geändert hat.

Außerdem sollte die Nadel nach dem Entfernen vom Stab entsorgt werden, um eine genaue Messung der mRNA-Nuklearexportkinetik zu erhalten. Separate Proben sollten nach null Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten fixiert werden. Nach der Behandlung mit Alpha-Manin zur entsprechenden Zeit das Wachstumsmedium absaugen und die Zellen zweimal mit jeweils zwei Millilitern PBS-Lösung waschen.

Es ist wichtig, die Deckgläser feucht zu halten, indem die Zeit, in der sie nicht in Flüssigkeit getaucht sind, minimiert wird. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter 4 % Aldehyd in PBS hinzufügen, und inkubieren Sie die Zellen mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem die fixierten Proben zwei weitere Male gewaschen wurden, permeabilisieren Sie die Zellen mit zwei Milliliter 0,1 % Triton X-100 in PBS und inkubieren Sie die Zellen erneut mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Proben abschließend noch zweimal, um sie für die Hybridisierung vorzubereiten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Waschpuffer aus einer XSSC-Lösung, die 25 bis 60 % Formamid enthält. Bereiten Sie dann die Färbevorrichtung für die Hybridisierung vor, indem Sie den Boden einer 150 Millimeter Petrischale mit Wasser bedecken und ein Stück Paraform darauf schwimmen lassen.

Entfernen Sie das Wasser, indem Sie die Schale umdrehen, sodass das Paraform auf der Unterseite der Schale haften bleibt. Entfernen Sie manuell alle Luftblasen für jeden Deckglaser, der angefärbt werden soll. Geben Sie 100-Mikroliter-Tropfen der Hybridisierungslösung auf das Paraform.

Beachten Sie, dass die Menge an Formage für das jeweils verwendete Fisch-Protokoll mithilfe einer Pinzette optimiert werden sollte. Entfernen Sie eine Deckglas mit fixierten Zellen aus der 30-Millimeter-Petri-Schale. Trocknen Sie mit Watman-Filterpapier die Rückseite des Deckglases und saugen Sie überschüssiges Puffermedium von der Vorderseite ab, ohne die Zellen dabei zu trocknen.

Danach das Deckglas mit der Oberseite nach unten in die Fischlösung legen. Diesen Vorgang für jedes Deckglas wiederholen. Nachdem der Deckel der Färbekammer wieder aufgesetzt wurde, die Proben fünf bis 18 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Bereiten Sie mehrere Waschkammern auf die gleiche Weise vor wie die Färbe-Kammer; pipettieren Sie je einen Milliliter Waschpuffer auf die Paraform der Wasch-Kammer. Entfernen Sie nach der Inkubation die Deckgläser aus der Färbe-Kammer, indem Sie einen Milliliter Waschpuffer pipettieren. Neben dem Deckglas sollte die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung unter jede Probe gezogen werden.

Entfernen Sie dann die Deckgläser mit einer Pinzette und legen Sie jedes auf einen Tropfen Waschpuffer, der fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Waschen Sie jedes Deckglas noch zweimal, sodass insgesamt drei Waschschritte pro Deckglas durchgeführt werden. Geben Sie 10 bis 30 Mikroliter Eindecklösung mit DAPI auf einen zuvor gewaschenen Objektträger. Jeder Objektträger kann zwei Deckgläser aufnehmen; verwenden Sie dazu eine Pinzette und Watman-Filterpapier.

Trocknen Sie die Rückseite der Deckgläser ab und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der Vorderseite des Deckglases, ohne die Proben zu trocknen. Legen Sie jedes Deckglas mit der Probenfläche nach unten auf einen Tropfen Eindecklösung. Die eingebetteten Proben können bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Hier zeigten die Wirkungen von Alpha-Mantin auf die Transkription injizierter Plasmid-DNA in NIH-3T3-Fibroblasten, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Alpha-Mantin vorbehandelt wurden. Es wurden TFLs Delta I, Plasmid-DNA und OG-konjugiertes 70-Kilodalton-Dextran injiziert. Jede Zeile entspricht einem einzelnen Bildfeld, das für OG-70-Kilodalton-Dextran und T-uts-Delta-I-mRNA abgebildet wurde.

Es ist ersichtlich, dass hohe Konzentrationen des Wirkstoffs die Produktion des T-UTS-delta-I-Transkripts vollständig inhibierten, während dies bei niedrigeren Konzentrationen nicht beobachtet wurde. Dargestellt ist hier ein Zeitverlauf der mRNA-Kernexportkosten. Sieben Zellen wurden mit T-UTS-delta-i-Plasmid-DNA und OG-konjugiertem 70-Kilodalton-Dextran injiziert.

30 Minuten nach der Injektion wurden die Zellen mit Alpha-Mantin behandelt und bei 37 Grad Celsius für null Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und mit einer Sonde gegen T UTS delta I mRNA sowie mit Antikörpern gegen das ER-Marker-Protein Trap Alpha gefärbt. Jede Zeile entspricht einem einzelnen Zellfeld.

Informationen zur Quantifizierung des mRNA-Exports finden Sie im Online-Text hier. Der Zeitpunkt von 120 Minuten wurde vergrößert, um die Kolokalisation von TFS delta I mRNA im ER zu demonstrieren; eine Überlagerung der T UTS delta I mRNA in grün und des TRAP alpha in rot ist dargestellt. Informationen zur Kostainierung von mRNA mit Proteinen sind im Online-Text zu finden.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Exportkinetik von mRNA aus dem Zellkern durch Mikroinjektion misst. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass eine erfolgreiche Mikroinjektion eine sorgfältige Vorbereitung erfordert. Wichtige Schritte wie die Herstellung von DNA und RNA, die Probenvorbereitung, das Ziehen von Injektionsnadeln, die Ausrichtung der optischen Geräte sowie die Fehlerbehebung bei der Mikroinjektion sind in unserem schriftlichen Protokoll beschrieben.

Bei der Bildgebung und Analyse von mikroinjizierter mRNA ist es wichtig, dass die Quantifizierung auf Zellen beschränkt bleibt, die mehr als 90 % der injizierten Flüssigkeit in den Zellkern aufgenommen haben. Eine erfolgreiche nukleäre Injektion kann beurteilt werden, indem die Verteilung von Organ Green-Dextran im Zellkern und im Zytoplasma visualisiert wird. Weitere Informationen zum Entwurf von FISH-Sonden sowie zur Verwendung von Bildanalyse-Software zur Untersuchung der Verteilung von mRNA im Zytoplasma und im Zellkern finden Sie in unserem Online-Protokoll.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.