Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

Hallo, mein Name ist Ken Paradiso. Ich arbeite für Ling Gang Wu im Intramural-Programm des National Institute of Neurological Disorders and Stroke, das sich auf dem Bethesda-Campus des NIH befindet. Ich werde Ihnen die Techniken für die kalizierte präsynaptische Ableitung mittels Patch-Clamp-Verfahren zeigen.

Um das Gehirngewebe vorzubereiten, entnehmen wir das Gehirn der Ratte. Wir legen das Gehirn in diese Lösung, die eiskalt sein muss und einen niedrigen Kalziumgehalt aufweist, und lassen sie mit Carbogen durchblubbeln, um sicherzustellen, dass das Gehirn jederzeit mit Sauerstoff versorgt wird. Außerdem muss die Lösung eiskalt sein, um die DA zu minimieren, also die Schädigung so gering wie möglich zu halten.

Das Gehirn befindet sich nun in dieser Lösung. Wir nehmen es heraus und schneiden es entsprechend zu, sodass es auf den Block aufgebracht werden kann, wobei es mit Sano Correlate oder Sekundenkleber auf dem Block befestigt wird. Anschließend füllen wir die Kammer mit eiskalter, kalziumarmer Lösung, belüften sie, platzieren sie auf dem Vibratome und schneiden dann Schnitte mit einer Dicke von 180 bis 190 Mikron bei einer Schwingfrequenz von 70 Hertz und einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,01 bis 0,02 Millimetern pro Sekunde. Das entspricht 10 bis 20 Mikron pro Sekunde.

Nachdem jeder Schnitt angefertigt ist, überführen wir die Schnitte von der eiskalten Kochsalzlösung in diese Kammer, die eine normale Kaliumlösung enthält. Dies ist dieselbe Lösung, in der wir die Ableitungen durchführen, und sie hat eine physiologische Temperatur von 37 Grad. Anschließend lassen wir die Schnitte hier zur Erholung.

Es verbleibt hier eine halbe bis eine Stunde, bevor die physiologischen Experimente durchgeführt werden. Hier habe ich das Gehirn und werde es aus der Lösung herausnehmen. Dies ist ein größeres Gehirn zu Demonstrationszwecken.

Dies stammt von einer P20-Ratte. Wir werden sie umdrehen. Es ist der Hirnstamm, der uns interessiert.

Also dieser Bereich hier unten und der Kelch halten genau in diesem Bereich. Was wir nun tun werden, ist, den Rest des Gehirns abzuschneiden, den Hirnstamm zu isolieren und dann den Hirnstamm für die Schneidekammer vorzubereiten. Gut, wir werden also den Rest des Gehirns abschneiden, um lediglich den Hirnstamm zu isolieren.

Ich werde es umdrehen, um zu zeigen, wo wir uns befinden. Normalerweise würden wir es nicht auf diese Weise tun, und erneut können wir diesen gesamten Bereich einfach entfernen. Wenn wir es wieder zurückdrehen, haben wir den Hirnstamm isoliert und führen gerade einen weiteren Schnitt genau dort durch.

Okay, das war's. Das ist der Hirnstamm. Die Calyces of Held befinden sich ungefähr dort und dort.

Das ist der Hirnstamm. Auch hier schieben wir ihn leicht zurück. Wir werden eine Seite des Kleinhirns abschneiden, wodurch der Hirnstamm seitlich so liegen kann.

Wir geben etwas Sano-Acrylkleber hinein und füllen es, während es seitlich liegt, schnell mit kaltem Eis und kalter, kalciumarmer Lösung auf. Bringen Sie die Sauerstoffleitung so schnell wie möglich hinein. Danach heben wir es auf und bringen es zum Vibratome.

Wir bewegen uns schnell voran, um den Beginn des Gehirns zu erreichen, und sobald wir dort angekommen sind, verringern wir die Geschwindigkeit auf 0,01 Millimeter pro Sekunde. Das entspricht 10 Mikrometer pro Sekunde. Die Bewegung erfolgt also mit einer unglaublich langsamen Rate.

Der erste Abschnitt des Gehirns ist der Teil, der den mtb aufweist, also den medialen Kern des Trapezkörper. Und das ist der Teil, der das enthält. Okay, sobald ich es in der Transferpipette habe, versuche ich, es so nah wie möglich an die Spitze der Pipette heranzubringen. Und dort ist die Gehirnscheibe, die ich ziemlich schnell in diese Kammer überführe, die eine Standard-Aufzeichnungslösung mit normalen Kalziumkonzentrationen sowie einer höheren Temperatur enthält.

Und das ermöglicht es den Schnitten, sich nach den Schneidprozeduren zu erholen, sodass sie für physiologische Experimente bereit sind. Okay, von hier an wird es immer dasselbe sein. Die folgende Ausrüstung werde ich für die Patch-Clamp-Technik verwenden.

Wir verfügen über ein aufrechtes Mikroskop mit feststehendem Objekttisch. Der Tisch ist, wie bereits erwähnt, feststehend, sodass sich das Mikroskop darunter über einen Manipulator bewegt. Wir verwenden einen Wigs-and-Newman-Mikromanipulator, um den Tisch und den Kopfverstärker zu halten; als Patch-Clamp-Verstärker setzen wir den EPC 10 von HECA ein.

Und was ich ebenfalls erwähnt haben sollte, ist, dass wir DIC mit Infrarotlicht verwenden. Wir verfügen hier über eine IR-Kamera, sodass alles, was wir sehen, auf dem Bildschirm angezeigt wird, wenn wir nach CAEs suchen. Der Patch-Clamp-Verstärker wird über eine Software gesteuert, die Pulse heißt und ebenfalls von Heca stammt; sie steuert den Verstärker und das gesamte physiologische Experiment.

Die Ergebnisse werden auf diesem Bildschirm angezeigt. Der Calyx, den wir untersuchen, ist ein großes präsynaptisches Terminal, und da es groß ist, können wir physikalisch eine Aufzeichnungselektrode an das Terminal anlegen. So ist es uns möglich, präsynaptische Ableitungen vorzunehmen, was insbesondere im zentralen Nervensystem eine Besonderheit darstellt.

Dadurch können wir präsynaptisch aktivierte Kalziumkanäle messen. Außerdem können wir, falls gewünscht, die Aktivität von Aktionspotentialen messen, indem wir den Nerv reizen, der zur Calyces führt. In diesem Labor messen wir einen Prozess, der als Exozytose bezeichnet wird und bei dem Vesikel, die Neurotransmitter enthalten, mit der Membran fusionieren.

Nun, wenn diese Vesikel im Prozess der Exozytose mit der Membran verschmelzen, fügen sie der synaptischen Endigung Membran hinzu, was wir als Kapazitätsänderung messen können. Wir erhalten eine Kapazitätszunahme, wenn Membran zur Endigung hinzugefügt wird. Die Experimente, die ich heute zeigen werde, sind also Kapazitätsmessungen präsynaptisch während der Membranentfernung. Man kann also nicht einfach kontinuierlich Membran hinzufügen, sondern muss natürlich auch jeweils etwas wieder entfernen.

Dieser Vorgang wird Endozytose oder Membranaufnahme genannt. Wir können dies ebenfalls messen, und dies wird als Abnahme des Kapazitätsniveaus erfasst; Beispiele dafür werden wir später zeigen. Dadurch können wir nun die Aktivität von Kalziumkanälen überwachen sowie einige der an Exozytose und Endozytose beteiligten Proteine untersuchen und analysieren.

Wir können beispielsweise Peptide hinzufügen, um Proteine zu blockieren, die an der Exo- oder Endozytose beteiligt sind. Außerdem können wir Toxine verwenden, die dieselbe Wirkung haben. Ferner können wir die Mengen an Calcium, das in das Endstück eindringt, regulieren, sodass wir den Exozytosevorgang, die Freisetzung von Neurotransmittern sowie die anschließende Aufnahme der Membran detailliert untersuchen können.

Dies ist die Röhre mit unserer intrazellulären Ableitungslösung. Wir stellen sie im Voraus her und frieren sie dann ein. Normalerweise kann sie mehrere Wochen bis zu einem Monat verwendet werden, bevor eine neue Lösung hergestellt werden muss. Unmittelbar vor der Durchführung unserer Ableitungen erhitzen wir sie erneut, und es gelangt immer eine gewisse Menge an Staubpartikeln oder anderen Verunreinigungen in die Röhre.

Sie können eine von zwei Maßnahmen ergreifen. Entweder nehmen Sie die Lösung heraus und filtrieren sie, oder Sie zentrifugieren sie eine oder zwei Minuten lang und ziehen dann die Lösung ab, wobei ein unterer Teil zurückbleibt, der Ablagerungen und anderes Material enthält. Ich bevorzuge die Zentrifugation, und das werde ich jetzt gleich durchführen.

Dies ist also die Röhre mit unserer intrazellulären Lösung. Sie ist aufgetaut. Wir werden sie etwa zwei bis drei Minuten lang in einer kleinen Zentrifuge zentrifugieren, was ausreichen sollte, um eventuelle größere Staubpartikel aus der Lösung zu entfernen.

Jetzt ziehe ich einfach die obere Phase, die Lösung, die wir gerade zentrifugiert haben, vorsichtig ab, ohne sie zu verwirbeln, und überführe sie in ein sauberes Röhrchen. Dabei entferne ich etwa 90 % der Flüssigkeit. Ich versuche erneut, nicht den letzten kleinen Rest mitzunehmen. Ich höre also genau an dieser Stelle auf.

Dies stellte ich sofort auf Eis, damit es während des Experiments schön kalt bleibt. Das ist sehr wichtig. Das ist, das ist eine unserer Pipetten.

Wir verwenden dies für intrazelluläre Ableitungen. Es handelt sich um wandstarkes Bohrsilicatglas mit zwei Millimetern Außendurchmesser und 1,16 Millimetern Innendurchmesser. Zunächst füllen wir die Pipette rückwärts.

Wir saugen also an, indem wir die Pipette in die Aufzeichnungslösung geben und Unterdruck anlegen, um die sehr, sehr feine Spitze der Pipette zu füllen, da sie auf andere Weise nicht gefüllt werden würde. Danach nehmen wir ein kapillares Schläuchchen und füllen den Rest der Elektrode, indem wir das hintere Ende der Pipette verwenden. Dies ist eine Standardmethode der Physiologie, bei der man buchstäblich leicht dagegenstößt.

Sie laufen Gefahr, die Spitze der Pipette zu beschädigen, aber wenn Sie dies nicht tun, entstehen oft Luftblasen. Gut, wir setzen sie nun in unseren Pipettenhalter ein, der mit der Kopfstufe des Patch-Clamp-Verstärkers verbunden ist. Dort befindet sich ein Silberchlorid-Draht.

Der Silberchlorid-Draht kommt in Kontakt mit der intrazellulären Lösung, und das ermöglicht uns, die elektrische Aktivität in der präsynaptischen Endigung zu messen. Wir suchen also die Schnittstelle, die viele CAEs enthält. Wir benötigen eine hohe Dichte an CAEs.

Wir suchen also den medialen Kern des Trapezkörpers, also die MNTB, und dort befindet sich die Endigung, die die Kalyptra bildet, beziehungsweise der Kalix-Ap, wie er vorzufinden ist. Daher beginnen wir damit, durch den Schnitt zu scannen. Zum Beispiel haben wir dort einen Kalix, der etwas tiefer unterhalb der Oberfläche liegt, und an dem nicht viel zum Anpatchen ist, weshalb wir einfach weiter beim Scannen über die Probe fortfahren.

Das ist hier ein Kelch, auf den wir zielen. Ich habe zwei Markierungen auf dem Bildschirm angebracht, an denen die Pipette eindringen wird. Sie können sehen, dass dort das Kelchstück liegt, das ich ansprechen werde; die Pipette wird herunterkommen.

Ich werde positiven Druck ausüben, sodass dieser gegen die Kalix drückt, und anschließend den positiven Druck abbauen. Die Kalix wird sich dann gegen die Pipette drücken, und zu diesem Zeitpunkt werde ich sehr sanfte Absaugung anwenden und versuchen, die Membran anzusaugen oder zu bewegen, damit sie sich auf der Pipettenspitze abdichtet. Gut, den positiven Druck abgebaut.

Und jetzt werde ich Saugung anwenden. Hier wenden wir also ein Fünf-Millivolt-Impuls an, beziehungsweise eigentlich ein Vier-Millivolt-Impuls. Okay, das war's. Okay.

Jetzt senken wir das Membranpotenzial auf minus 80 und unterdrücken den schnellen transienten Ausschlag. Nun wechseln wir in die Ganzzell-Konfiguration. Ich werde sanften Saugdruck anlegen und versuchen, die Ganzzell-Konfiguration zu erreichen.

Diese Lade-Transients zeigen an, dass er, dass die Pipette und die Zelle nun kontinuierlich verbunden sind, dass er eine vollständige Ableitung erzielt hat. Das ist wieder eine hervorragende Aufnahme. Die hellere rote Linie dort war die Kapazitätskurve, und Sie können einen plötzlichen Anstieg erkennen, gefolgt von einem Abfall.

Okay, ich habe Ihnen die grundlegenden Techniken zur Ableitung von Aufzeichnungen von einem kalzartig umhüllten präsynaptischen Terminal gezeigt. Ich habe Ihnen gezeigt, wie man Schnitte herstellt, die den medialen Kern des Trapezkörpers enthalten. Dort finden Sie die kalzartig umhüllten Strukturen vor.

Und ich habe Ihnen die Techniken zum Durchsuchen der Schnitte gezeigt. Sie werden jeden Schnitt durchgehen und nach dem Schnitt suchen, der die größte Anzahl an Calyces an der Oberfläche aufweist. Anschließend suchen Sie nach der größten Calyx-Membran, die Sie finden können, und führen eine Patch-Clamp-Aufzeichnung an ihr durch.

Und ich habe Ihnen auch die Techniken der Patch-Clamp-Ableitung gezeigt, und das sind Standard-Techniken der Patch-Clamp-Ableitung.