Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Migration von Krebszellen mithilfe eines unterteilten mikrofluidischen Geräts visuell zu untersuchen und zu charakterisieren. Dies wird zunächst durch die Dissoziation bereits bestehender Neurosphären von Gehirntumorstammzellen erreicht, die in serumfreiem Medium gezüchtet wurden. Der zweite Schritt besteht darin, einen zweischichtigen SU-8-Master herzustellen und mittels Soft-Lithographie eine PDMS-Abformung (A-P-D-M-S) anzufertigen, die ein unterteiltes Design aufweist.

Als Nächstes wird das mikrofluidische Gerät zusammengesetzt und mit Gehirntumorstammzellen beladen. Schließlich wird eine Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der Migration von Gehirntumorstammzellen mithilfe eines kompakten mikroskopischen Systems durchgeführt. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass Gehirntumorstammzellen während ihrer Migration durch extrem eng begrenzte Räume eine sich drehende Abfolge morphologischer Stadien durchlaufen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Systemen wie der Transwell-Boyton-Kammer liegt darin, dass mikrofluidische Vorrichtungen eine visuelle Überwachung des Migrationsprozesses, eine gezielte Platzierung von Zellen sowie eine präzise Applikation von Faktoren ermöglichen. Daher weist die Mikrofluidik-Technologie Merkmale einer zuverlässigen, effizienten und kostengünstigen Einzelzellselektion und -navigation auf. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik reichen bis in die Therapie von Krebsmetastasen und -rezidiven hinein, da die Einzelzellanalyse stark migrierender Zellen potenzielle zukünftige zielgerichtete Chemotherapieansätze identifizieren könnte.

Obwohl diese Methode Einblicke in das Migrationsverhalten von Krebssystemen ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise die embryonale Entwicklung, Immunantworten, Wundheilung und Organregeneration. Beginnen Sie mit der Zellsuspension von BTSC-abgeleiteten Neurosphären. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie sie bei 900 U/min fünf Minuten lang, jedoch nicht schneller.

Aspirieren Sie das Überstandmedium. Lassen Sie dann die Neurosphären durch eine Inkubation in 0,5 Milliliter vorgewärmtem Accutase für fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius lösen. Nach der Inkubation lösen Sie die Zellen mechanisch durch 10 bis 20 vorsichtige Auf- und Ab-Bewegungen mit einer P-100-Pipette auf.

Gegeben Sie anschließend 1,5 Milliliter Stammzellmedium zu, um das Accutase-Zentrifugat zu neutralisieren, zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1300 U/min für fünf Minuten und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Stammzellmedium. Überprüfen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Dichte auf 20.000 Zellen pro Mikroliter ein. Um mit der Herstellung der SU-8-Masterform zu beginnen, bereiten Sie zwei Fotomasken unter Verwendung von Adobe Illustrator und laserbedrucktem Transparentfolienfilm mit integriertem Imagesetter vor.

Die Fotomaskenschicht der ersten Ebene besteht aus zwei Referenzmarkierungen und einem Array von Mikrokanälen, die zweite Ebene der Fotomaskierung weist die Halterungen und Aufnahmekammern auf. Reinigen Sie beide Maskenschichten mit Isopropanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Beschichten Sie nun eine Trägerwafer-Scheibe durch Schleuderbeschichtung mit einem drei Mikrometer dicken SU-8-Photoresist, gefolgt von einer Vorvernetzung.

Bringen Sie dann mit der ersten Schicht-Fotomaske einen engen Kontakt mit UV-Licht her, belichten Sie das Foto, entwickeln Sie den Lackschutz und lassen Sie ihn aushärten. Anschließend führen Sie eine Nachbekaung durch und entwickeln die ausgehärte Wafer. Decken Sie die Referenzmarkierungsbereiche des Trägerwafers mit Klebeband ab.

Tragen Sie dann den Fotolack mit einer Dicke von 250 Mikrometern mittels Schleuderbeschichtung auf das Wafer auf. Anschließend entfernen Sie das Klebeband, um die Markierungen für die Ausrichtung freizulegen. Bringen Sie die zweite Schicht Fotolack auf und richten Sie sie anhand der Referenzmarken aus.

Danach die zweite Schicht des Fotomasks mit UV-Licht belichten und aushärten, gefolgt von Nachbrennen und Entwickeln. Nun die SU-8-Masterform durch Dampfablagerung behandeln, um die Oberflächenhaftneigung zu verringern. Die Wafer in einen Trockner mit mehreren Tropfen Trichloramin-Lösung unter Vakuum für mindestens eine Stunde geben.

Die Negativform ist dann gebrauchsfertig, um PDMS damit zu gießen. Mischen Sie zunächst die Präpolymer-Basis gründlich mit dem Härter im Verhältnis 10 zu 1. Geben Sie danach das Gemisch in einen Exsikkator, um es unter Vakuum zu entgasen, bis keine Luftblasen mehr sichtbar sind.

Geben Sie die Mischung auf die Maske und entgasen Sie erneut. Wenn neue Luftblasen entstehen, härten Sie die Form zwei Stunden lang bei 90 Grad Celsius auf einer ebenen Heizplatte aus. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur lösen Sie den PDMS-Stempel vorsichtig.

Daher sind Kultivierungskanäle in PDMS eingeprägt und bereit für die Montage des mikrofluidischen Geräts. Der Master kann bis zum Bruch oder zur Abnutzung wiederverwendet werden. Wenn der Master klebrig wird, kann die Antihaftbeschichtung erneut aufgetragen werden.

Beginnen Sie mit der Herstellung von Einlässen und Auslässen in der mikrofluidischen Vorrichtung durch den PDMS-Abdruck. Reinigen Sie den PDMS-Abdruck mithilfe einer Biopsie-Lochstanzung, indem Sie ihn 30 Minuten lang in 70 %igem Ethanol einweichen und anschließend 10 Minuten lang mit entionisiertem Wasser spülen. Sterilisieren Sie den PDMS-Abdruck und vervollständigen Sie die Vernetzungsreaktionen durch Autoklavieren.

Legen Sie nun den PDMS-Stempel auf eine mit Poly-L-Lysin beschichtete Glasdeckfolie. Anschließend wird das Gerät beschichtet, indem die Kammern über die Reservoirzuführungen mit Laminatlösung gefüllt und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Am nächsten Tag saugen Sie das Laminat vom Gerät ab.

Spülen Sie das Gerät anschließend, indem Sie es zweimal mit Stammzellmedium überfluten. Geben Sie nun 11 Mikroliter dissoziierte Zellen in eines der Aussaatreservoirs. Falls erforderlich, verwenden Sie eine Vakuumabsaugung, um die Zellen in die Kammer zu ziehen. Füllen Sie anschließend weitere sieben Mikroliter Zellen in das angrenzende Sitzreservoir nach.

Nach fünf Minuten werden die Sitz- und Empfangsreservoirs mit Medium überschwemmt. Legen Sie nun eine sterile PDMS-Schicht mit einer Dicke von 0,5 bis einem Millimeter auf das Gerät. Die natürliche Oberflächenadhäsion von PDMS mit sich selbst versiegelt das Gerät; sobald es versiegelt ist, ist es bereit für den Transport, die Inkubation und die mikroskopische Bildgebung.

Das Biot-IM vorab 45 Minuten lang im Voraus äquilibrieren, indem es betrieben wird. Um Temperatur, Feuchtigkeit und Luftzufuhr zu stabilisieren, mehrere Schalen mit Wasser in die Probenkammer stellen, um die richtige Luftfeuchtigkeit zu erreichen. Das vorbereitete Gerät in die Probenkammer des Mikroskops einladen.

Zentrieren Sie das Gerät mit Mikrozangen. Legen Sie nun die Fokuspunkte und Zeitpunkte mithilfe der Biot-Software fest und starten Sie gegebenenfalls die Zeitrafferaufnahmen. Nach fünf Tagen im Kulturmedium ersetzen Sie das Kulturmedium.

Die in der Vorrichtung ausgesäten BTCs wurden kontinuierlich mittels Phasenkontrastbildgebung aufgezeichnet. Fünf Tage lang blieben spindelförmige Zellen im Sitzkammerabschnitt in der Prä-Migrationsphase. Als sie sich dem Mikrokanaleingang näherten, dehnten sich einige Zellen aus und bildeten adhesive Ausläufer.

Nur eine Zelle konnte den Eingang besetzen und die Migrationsrichtung erkunden. Sobald die Zelle die Migrationsrichtung bestimmt hatte, bewegte sie sich mit konstanter hoher Geschwindigkeit entlang des gesamten Mikrokanals. Am Ende des Mikrokanals erkundete die Zelle den Freiraum der Empfangskammer, bevor sie schließlich in diese eindrang.

Bei der Beobachtung der Zellen mit zwei Sekunden langen Bildintervallen schien die Migrationskraft hauptsächlich durch eine blasende Aktivität erzeugt zu werden, die der von OID-Zellen ähnelt. Bei der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass die Konstruktion des Geräts so flexibel ist, dass die Abmessungen der Mikrokanäle angepasst werden können, um ein gewünschtes Ausmaß an Zellmigration zu erreichen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein einzigartiges unterteiltes mikrofluidisches Gerät herstellt, das für das Kultivieren Ihrer Zellen von Interesse geeignet ist, und anschließend eine langfristige Zeitrafferaufnahme durchführt, um die migratorischen Eigenschaften dieser Zellen im Anschluss an dieses Verfahren qualitativ und quantitativ zu charakterisieren.

Andere Methoden wie die Next-Generation-Sequenzierung oder DNA-Microarrays können angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, wie stark sich die hochmigratorischen Krebszellen genetisch unterscheiden.