Klonogene Test: adhärenter Zellen

Hallo, ich heiße Lum und absolviere derzeit meine Promotion am BE IDI Heart and Diabetes Institute unter der Betreuung von Dr. Tom Carianne, Leiter des Labors für Epigenomische Medizin. In diesem Video werde ich das Verfahren namens Clon Genic Survival Assay demonstrieren. Dabei handelt es sich um eine 50 Jahre alte Technik, die es ermöglicht, die Auswirkungen verschiedener Behandlungen – wie beispielsweise die Exposition gegenüber Strahlung oder chemischen Substanzen – auf die reproduktive Zellviabilität zu bewerten.

Der konogene Überlebensassay ist eine zentrale Technik in der Strahlenbiologie, um die Strahlenempfindlichkeit verschiedener Zelllinien zu bewerten und die Wirksamkeit unterschiedlicher strahlenschützender oder strahlensensibilisierender Verbindungen zu testen. Bei Verwendung einer adhärenten Zelllinie besteht der kryogene Überlebensassay aus drei Phasen. Zunächst die Behandlung einer Monoschicht adhärer Zellen.

Zweitens die Herstellung einer Einzelzell-Suspension und das Ausplattieren einer bekannten Anzahl von Zellen auf beschichteten Platten sowie drittens die Färbung, Zählung und die nach einer Inkubationszeit gebildeten Kolonien. In diesem Video verwende ich immortalisierte humane Cino-Zellen, um zu demonstrieren, wie der polygenische Bibel-Assay genutzt werden kann, um die strahlenschützenden Eigenschaften des natürlichen Antioxidans zu bestimmen. 1225-Flaschen werden mit Zellen in fünf Milliliter Medium vorher beimpft, sodass am Tag des Experiments eine Million Zellen pro Flasche vorliegen.

50 µL der Droge werden in verschiedenen Konzentrationen zu den fünf Millilitern Medium in jedem entsprechend beschrifteten Kolben hinzugefügt, um die erforderliche Konzentration zu erreichen; fünf Konzentrationen werden verwendet, sowie in diesem Fall eine Fahrzeugkontrolle (PBS). Nach Zugabe der Droge werden die Zellen eine Stunde lang unter für die verwendete Zelllinie geeigneten Bedingungen inkubiert. Die Proben, ausgenommen die Kontrollgruppe, werden nach der Inkubation mit der gewählten Dosis bestrahlt, die in diesem Fall vier Gray beträgt und von einer Cäsiumquelle mit Gammastrahlung erzeugt wird.

Nach der Bestrahlung wird das Medium abgegossen und jeder Kolben wird mit zwei Milliliter PBS fünf Minuten lang gewaschen. Nach dem Abgießen des PBS werden zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsin zu jedem Kolben hinzugefügt, um die anhaftenden A-Zellen vom Kolben zu lösen. Anschließend werden fünf Milliliter DMEM, die 10 % fetalen Kälberserum enthalten, zu jedem Kolben gegeben, um die Trypsinwirkung zu stoppen.

Der gesamte Inhalt der Fasc wird anschließend in beschriftete 10-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführt. Nach Abschluss werden diese Röhrchen fünf Minuten lang zentrifugiert, wonach das Überstandsmaterial vorsichtig entfernt wird, ohne das Pellet zu stören, und jeweils fünf Milliliter Crezy-Medium zu jedem Röhrchen hinzugefügt wird. Die Zellkonzentration jeder Probe wird ermittelt, ebenso das erforderliche Volumen jeder Probe, um eine Endkonzentration der Zellen zu erreichen, die daraufhin auf fünf Petrischalen pro Probe mit jeweils fünf Milliliter Medium ausplattiert werden.

Beispielsweise werden für die Kontrollgruppe 100 Zellen pro Petrischale ausplattiert, daher wird das Volumen berechnet, das benötigt wird, um 500 Zellen pro 25 Milliliter zu erreichen. Bei konzentrierteren Proben wird entweder eine 10-fache Verdünnung oder eine 100-fache serielle Verdünnung durchgeführt, um den Fehler zu minimieren, der bei der Verwendung von Volumina unter 100 Mikrolitern entsteht. Das zuvor berechnete Volumen wird nun in ein Falcon-Röhrchen gegeben, das für jede Probe 25 Milliliter Medium enthält. Die Proben können nun in zuvor beschriftete Petrischalen überführt werden, wobei fünf Milliliter pro Schale zugegeben werden, um die Handhabung und den Transport zu erleichtern.

Bewahren Sie die Schalen in einem großen, sterilen oder desinfizierten Behälter auf. Anschließend werden die Schalen unter geeigneten Bedingungen in einen befeuchteten Inkubator gestellt und acht Tage lang inkubiert. Wenn Keratinozyten nach acht Tagen verwendet werden sollen, nehmen Sie die Schalen vorsichtig aus dem Inkubator und legen Sie sie einzeln in einer Abzugshaube aus.

Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit der Platte, damit eventuell gebildete Kolonien nicht gestört werden. Entfernen Sie die Deckel und geben Sie fünf ml 0,9 % Salzlösung in jede Schale, um sie zu spülen. Zielen Sie mit der Pipettenspitze in die Ecke der Schale und vermeiden Sie es, den Boden der Schale zu berühren, damit keine Kolonien versehentlich abgeschabt werden.

Nach fünf Minuten vorsichtig die Kochsalzlösung abpipettieren. Nun werden die Kolonien mit drei Milliliter 4%iger Formulierung fixiert, und die Deckel müssen ersetzt werden, um Verdunstung zu vermeiden. Nach 15 Minuten bis einer halben Stunde wird die Formulierung abpipettierter und fachgerecht entsorgt.

Die Kolonien können nun mit 0,1 % Kristallviolett angefärbt werden; fünf Milliliter werden jeder Schale zugesetzt, und die Deckel werden nach einer halben bis einer Stunde wieder aufgesetzt. Der Farbstoff wird anschließend mit destilliertem Wasser abgespült, und die Schalen werden umgedreht und über Nacht trocknen gelassen. Die Kolonien können nun gezählt werden.

Die Kolonien können manuell mithilfe eines Stereomikroskops gezählt werden. Jeder Zellverbund mit 50 oder mehr Zellen gilt als Kolonie. Damit ist unsere Demonstration des kongenen Überlebensassays abgeschlossen.

Der Hauptvorteil dieses Assays gegenüber anderen Techniken liegt in seiner außerordentlichen Empfindlichkeit, die es ermöglicht, das Überleben über einen weiten Bereich hinweg nachzuweisen, selbst nach einer Reduktion der Zellzahl um sechs Größenordnungen. Diese Empfindlichkeit wird durch das Ausplattieren größerer Zellzahlen erreicht. Dieser Assay kann leicht auch für andere Zwecke verwendet werden, beispielsweise zur Prüfung der Zytotoxizität.

Vielen Dank fürs Zuschauen.