Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Lanthanid-haltige Komplexe zu synthetisieren, zu reinigen und zu charakterisieren, die zur Markierung biologischer Makromoleküle verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst das metallhaltige Ausgangsmaterial und der Ligand unter Kontrolle des pH-Werts der Lösung miteinander vermischt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den resultierenden Komplex mittels Dialyse zu reinigen.

Danach muss das Fehlen freier Metallionen überprüft werden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Charakterisierung der für die Bildgebung relevanten Eigenschaften des Komplexes. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass die synthetisierten Komplexe durch Messungen der Relaxivität als Kontrastmittel wirken.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Bildgebung beantworten, beispielsweise, ob sich die Wasserkordinationszahl eines Kontrastmittels bei der Bindung an ein Protein verändert. Im Allgemeinen haben Personen, die diese Methode benötigen, Schwierigkeiten, da eine ungenaue Kontrolle des pH-Werts dazu führt, dass das LI für die biologische Ausbildung nutzlos wird. Die Demonstration der Dialyse und der Aktivitätsmessungen wird Buda und Sashi übernehmen.

Doktoranden aus meinem Labor: Um die Methylierung mit Lanthanid-Salzen zu beginnen, lösen Sie zunächst ein Äquivalent Ligand in Wasser, um eine Lösung von 30 bis 265 Millimolar herzustellen. Der hier verwendete Ligand Paraiso Benzyl DTPA liegt in einer Konzentration von 73 Millimolar vor. Anschließend stellen Sie den pH-Wert der Ligandlösung durch Zugabe von einmolarer Ammoniumhydroxidlösung auf einen Wert zwischen 5,5 und 7 ein.

In diesem Video werden nun 0,2 Milliliter der einmolaren Ammoniumhydroxidlösung verwendet, um ein bis zwei Äquivalente Lanthanidchlorid in Wasser zu lösen, wodurch eine Lösung mit einer Konzentration von fünf bis 1000 Millimolar entsteht. Entweder Europiumchlorid oder Gadoliniumchlorid kann in Konzentrationen von 111 Millimolar verwendet werden. Häufig wird ein Überschuss an Metall eingesetzt, um die Reaktion zur Vollständigkeit zu treiben und dadurch die Reinigung zu vereinfachen.

Fügen Sie anschließend jede Lösung der Lanthansalze unter Rühren zur vorbereiteten Ligandenlösung hinzu. Stellen Sie nun den pH-Wert der resultierenden Reaktionsgemische durch Zugabe von 0,2 molarer Ammoniumhydroxidlösung auf einen Wert zwischen 5,5 und sieben ein. Dabei werden insgesamt 0,5 Milliliter der 0,2 molaren Ammoniumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts verwendet.

Wenn der verwendete Ligand säureempfindliche funktionelle Gruppen enthält, stellen Sie den pH-Wert während dieses Schritts mehrfach ein. Achten Sie darauf, vorsichtig beim Einstellen des pH-Werts vorzugehen, da sonst basischem empfindliche funktionelle Gruppen wie Isothiocyanat unbrauchbar werden, falls die Lösung zu basisch wird. Überwachen Sie die Konjugation genau durch pH-Messungen.

Die Reaktion ist abgeschlossen, wenn der pH-Wert konstant bleibt. Bei Liganden ohne basisempfindliche funktionelle Gruppen kann eine Aufarbeitung, die eine Erhöhung des pH-Werts beinhaltet, ebenfalls nützlich sein. Um mit der Dialyseaufarbeitung zu beginnen, bestimmen Sie eine geeignete Länge an Dialysefolie, um das Probenvolumen sowie zusätzliche Länge für ein zusätzliches 10 % des Probenvolumens aufzunehmen. Befolgen Sie anschließend die Herstelleranweisungen, um die Folie auf diese Länge zu schneiden.

In diesem Video wurde eine Membran mit einer Molekulargewichts-Trenngrenze von 100 bis 500 Dalton verwendet, aber gegebenenfalls können auch Dialyse-Schläuche mit höherer Molekulargewichts-Trenngrenze verwendet werden, wenn die Konjugation vor der Methylierung durchgeführt wird. Falls erforderlich, gemäß den Herstelleranweisungen den zugeschnittenen Dialyse-Schlauch und Wasser 15 Minuten bei Raumtemperatur einweichen lassen. Füllen Sie anschließend ein Dialyse-Behältnis mit Wasser, das als Dialysat dient. Hier wird ein Ein-Liter-Becherglas verwendet.

Das Dialysatvolumen sollte etwa das 100-Fache des Probenvolumens betragen. Falten Sie nun ein Ende des Schlauchs zweimal und sichern Sie den gefalteten Bereich mit der Dialyseverschlussklemme. Wickeln Sie ein Gummiband um das Ende der Klemme, um sicherzustellen, dass sie während der Dialyse geschlossen bleibt.

Filtrieren Sie die zuvor vorbereitete Reaktionsmischung durch einen 0,2-Mikron-Filter. Anschließend geben Sie das Filtrat in das offene Ende des Schlauchs. Achten Sie dabei darauf, den Schlauch nicht zu zerreißen.

Stellen Sie sicher, dass genügend Platz verbleibt, um den Schlauch zu verschließen. Falten Sie das verbleibende offene Ende des Schlauchs zweimal und befestigen Sie es mit einer Verschlussklemme. Wickeln Sie anschließend ein Gummiband um die Klemme. Befestigen Sie danach ein Glasfläschchen, das Luft enthält, mithilfe eines weiteren Gummibands an der Klemme an einem Ende des Dialyse-Schlauchs.

Befestigen Sie dann ein Gefäß mit Sand am anderen Klemmhalter. Diese Gefäße stellen sicher, dass die Schläuche im Dialysat eingetaucht bleiben. Legen Sie nun die kompletten Schläuche in das Dialysebehältnis, das Dialysat enthält.

Rühren Sie das Dialysat mithilfe eines magnetischen Rührers bei Raumtemperatur langsam um. Achten Sie darauf, dass die Rührgeschwindigkeit gering bleibt und die Lösung nicht verwirbelt wird. Wechseln Sie das Dialysat innerhalb eines Tages dreimal.

In diesem Video wird das Dialysat nach 2,5, 6,5 und 11,5 Stunden gewechselt. Lassen Sie die Dialyse über Nacht weiterlaufen, insgesamt 20 bis 28 Stunden. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, entfernen Sie das Röhrchen vom Dialysat und öffnen vorsichtig eine Verschlusskappe, um die Probe zu entnehmen.

Spülen Sie das Dialysegerät dreimal mit Wasser und vereinigen Sie die Spülflüssigkeiten mit der Probe. Entfernen Sie abschließend das Wasser aus der Probe unter vermindertem Druck. Dies erfolgt durch Gefriertrocknung.

Die Probe wird eingefroren und anschließend auf eine Gefriertrocknungsanlage gegeben. Um das Vorhandensein von freiem Metall in der Probe zu überprüfen, stellen Sie zunächst Acetatpuffer her, indem Sie 1,4 Milliliter Essigsäure in 400 Milliliter Wasser auflösen, den pH-Wert mit einmolarer Ammoniumhydroxidlösung auf 5,8 einstellen und Wasser hinzufügen, um ein Gesamtvolumen von 500 Millilitern zu erhalten. Lösen Sie danach jeweils 0,3 Milligramm des Komplexes in 0,3 Milliliter Puffer auf.

Bereiten Sie nun den Xol-Orange-Indikator vor, der in dem Puffer mit pH 5,8 eine Konzentration von 16 Mikromolar aufweisen sollte. Geben Sie drei Milliliter dieser Indikatorlösung zu den zuvor gelösten Metallkomplexen hinzu. Weisen Sie das Vorhandensein freier Metallionen durch Beobachtung eines Farbumschlags des Indikators von gelb nach violett nach.

Falls gewünscht, kann die Menge an freiem Metall durch Erstellung einer Kalibrierkurve quantifiziert werden. Bleibt freies Metall zurück, sollte die Probe vor der Charakterisierung weitergereinigt werden, beispielsweise mittels Dialyse oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Als Nächstes bereiten Sie zur Bestimmung der Koordinationszahl von Wasser für eine Opiumprobe eine Lösung von etwa einem Millimolar des Opium enthaltenden Komplexes in Wasser sowie eine weitere Lösung derselben Konzentration in Deuteriumoxid vor.

Vor der Analyse muss die Deuteriumoxid-Lösung dreimal eingedampft und in Deuteriumoxid aufgenommen werden, um restliches Wasser zu entfernen; schalten Sie anschließend das Spektralfluorimeter ein, geben Sie die wässrige Lösung in eine saubere Küvette und platzieren Sie die Küvette in das Spektralfluorimeter. Führen Sie nun die Anregung und Emission durch, um die Maxima bei etwa 395 Nanometern bzw. 595 Nanometern zu bestimmen. Führen Sie danach ein Phosphoreszenz-Zerfallszeit-Experiment unter Verwendung der zuvor bestimmten Anregungs- und Emissionswellenlängen sowie der hier angezeigten Parameter durch.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer hergestellten Deuteriumoxid-Lösung. Erstellen Sie anhand der gerade erhaltenen Lumineszenz-Zerfallsdaten ein Diagramm des natürlichen Logarithmus der Intensität über der Zeit. Die Steigungen dieser Geraden entsprechen den Zerfallskonstanten. In diesem Video wurde Microsoft Excel 2007 verwendet, um die Diagramme des natürlichen Logarithmus aus den Rohdaten zu erstellen.

Verwenden Sie die Zerfallsraten in der hier gezeigten, von hors und Mitarbeitern entwickelten Gleichung. Wenn Ihr Ligand OH- oder NH-Gruppen enthält, die an das Metall koordiniert sind, muss die Gleichung vor der Anwendung modifiziert werden. Um zunächst die Relativitätsmessungen der Probe zu bestimmen, wählen Sie am Relaxationszeitanalysator den gewünschten Anwendungsmodus, entweder T eins oder T zwei.

Hier wird die T-eins-Einstellung ausgewählt. Als Nächstes bereiten Sie eine Reihe von Proben vor, die unterschiedliche Konzentrationen des Lanthanid enthaltenden Komplexes in einem geeigneten Lösungsmittel enthalten. Hier wird Wasser als Lösungsmittel verwendet und Lösungen mit zehn fünf zwei 0,5, 1,25, 0,625 und null.

Millimolare Lösungen werden hergestellt. Andere wässrige Lösungsmittel oder Puffer können verwendet werden, es ist jedoch wichtig, das Lösungsmittel als Blindwert zu verwenden. Das Endvolumen der Probe richtet sich nach dem verwendeten Instrument.

Platzieren Sie eine Probe im Gerät und lassen Sie sie fünf Minuten lang stehen, um sich auf die Temperatur des Geräts einzustellen, die für die in diesem Video verwendete Einheit 37 Grad Celsius beträgt. Bestimmen Sie nun die Relaxationszeit in Sekunden, indem Sie die Parameter der Software so anpassen, dass eine glatte exponentielle Kurve für T1 oder T2 erhalten wird. Wiederholen Sie dies für alle Proben, einschließlich der Blindprobe.

Berechnen Sie nun den Kehrwert der gemessenen T1- oder T2-Relaxationswerte und tragen Sie diese gegen die Lanthankonzentration in Millimolar (mM) auf. Fitten Sie die Daten mit einer Geraden. Die Steigung der angepassten Geraden entspricht der Relaxivität R1 bzw. R2 für T1 und T2.

Hier sehen wir das allgemeine Schema für die Vermittlung und Reinigung. Dieses Schema zeigt den allgemeinen Ablauf der Methylierung und die Gründe für die Wahl unterschiedlicher Reinigungswegen. Hier sehen wir eine repräsentative Abklingkurve der Lumineszenz, in der der natürliche Logarithmus des Abklingens über der Zeit aufgetragen ist. Die Steigungen der Geraden, die aus ähnlichen Kurven für Wasser- und Deuteriumoxid-Lösungen gewonnen werden, werden zusammen mit Gleichung eins verwendet, um die Wasserkordinationszahl von Opioid enthaltenden Komplexen zu bestimmen.

Ein repräsentatives Beispiel für Lebendigkeitsmessungen ist hier dargestellt, wobei die Steigung der angepassten Geraden die T-eins-Lebendigkeit der Probe angibt. Zusätzlich zur Beschreibung der Wasserkordinationszahl und der Lebendigkeitscharakterisierung, wie sie im Protokoll beschrieben ist, ist es ebenfalls wichtig, die Endprodukte mit standardmäßigen chemischen Methoden zu charakterisieren. Die Identität der Verbindung kann mittels Massenspektrometrie ermittelt werden; repräsentative Massenspektren, die die diagnostischen Isotopenmuster für Gadolinium- und Opium enthaltende Komplexe zeigen, sind hier dargestellt.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie ENDOR-Spektroskopie, HPLC und Elementaranalyse durchgeführt werden, um die resultierenden Komplexe genauer zu charakterisieren. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lanthanid-haltige Komplexe synthetisieren, reinigen und charakterisieren kann, die für die Markierung biologischer Makromoleküle verwendet werden können.