Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

Dieses Verfahren beginnt mit der Entfernung von Verunreinigungen aus der Influenza-Viruslösung durch Zentrifugation. Anschließend wird die virale Membran mit dem Tensid aufgelöst, und die freigesetzten VR-nps werden an einem Glycerin-Gradienten getrennt.

Die Zentrifugationsfraktionen aus dem Gradienten werden gesammelt und jeweils eine Aliquotprobe jeder Fraktion wird auf einem SDS-Polyacrylamidgel eingesetzt. Die Gele werden mit Kumasisierblau gefärbt, um die Spitzenfraktionen, die V-NPs enthalten, zu identifizieren. Die Fraktionen, die die V-NPs enthalten, werden anschließend durch Zentrifugation angereichert, und die gereinigten VRPs werden auf ein Kupfer-TEM-Präparatengitter aufgetragen, das danach negativ angefärbt wird, um die VRPs mittels Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen. Hallo, ich bin WinCo Wu im Labor von Dr. Nellie Pane am Fachbereich Zoologie der University of British Columbia.

Ich bin Lindsay Weaver, ehemals aus dem Pane-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Reinigung von Influenza-Ribonukleoprotein-Komplexen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um den nukleären Import des Influenza-A-Virus in Zellkulturzellen zu untersuchen.

Beginnen wir also. Geben Sie zu Beginn des Experiments 750 Mikroliter MNT-Puffer in ein 11 mm × 34 mm großes Beckman-Polykarbonat-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter einer 2 Milligramm pro Milliliter Lösung des Influenza-A-Virus hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um das Virus gründlich mit dem MNT-Puffer zu vermischen.

Nach dem Mischen das Röhrchen in einen A TLA one 20.2-Rotor geben und in einer Beckman Optima max E-Zentrifuge 10 Minuten bei 109.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Nach Beendigung des Zentrifugierens den Überstand entfernen und das Pellet in 500 µL Aufschlusspuffer resuspendieren. Das resuspendierte Pellet kräftig verwirbeln und anschließend 20 Minuten bei 31 °C in einem Einor-Thermomischer schütteln.

Wenn das Schütteln abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Sedimentationsgeschwindigkeitszentrifugation über einen Glycerin-Gradienten fort. Um den Glycerin-Gradienten vorzubereiten, geben Sie die folgenden Mengen Glycerin in eine Beckman UltraClear-Zentrifugenröhrchen mit den Maßen 13 Millimeter mal 51 Millimeter: ein Milliliter 70 % (Volumen pro Volumen) Glycerin, 0,75 Milliliter 50 % Glycerin, 0,375 Milliliter 40 % Glycerin und 1,8 Milliliter 33 % Glycerin. Diese Glycerin-Lösungen werden hergestellt, indem reines Glycerin mit NM-Puffer gemischt wird.

Bereiten Sie außerdem ein Ausgleichsröhrchen mit Glycerin und Puffer vor. Vortexen Sie die aufgeschlossene Virusprobe erneut und geben Sie sie auf den Glycerin-Gradienten. Stellen Sie das Röhrchen in einen Beckman MLS 50-Schwingkorbrotor und zentrifugieren Sie den Gradienten drei Stunden und 45 Minuten bei 217.000 × g und vier Grad Celsius.

Nach Abschluss der Zentrifugation manuell 250 Mikroliter-Aliquote des Gradienten beginnend von der Oberseite des Röhrchens sammeln. Die Fraktionen auf Eis oder bei vier Grad Celsius lagern. Sobald die Fraktionen gesammelt sind, können wir sie mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysieren.

Um die SDS-Page-Analyse zu beginnen, entnehmen Sie 20 Mikroliter aus jeder Fraktion in ein frisches Gefäß. Fügen Sie anschließend fünf Mikroliter fünfmal konzentrierten SDS-Page-Probelösepuffer hinzu und erhitzen Sie die Probe fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Nach dem Erhitzen zentrifugieren Sie die Proben kurz und geben Sie sie auf ein 10 %iges Polyacrylamidgel; verwenden Sie in einem der Gelenlöcher Molekulargewichtsmarker. Führen Sie danach die Proben durch das Gel, bis sich der Bromphenolblau-Ladefarbstoff nahe dem unteren Rand des Gels befindet.

Entfernen Sie das Gel aus der SDS-Page-Apparatur und färben Sie das Gel mit Kumasisierblau. Identifizieren Sie anhand der Färbungsergebnisse die Fraktionen, die hauptsächlich Influenza-A-Nukleoprotein enthalten.

Das Influenza-A-NP ist etwa 56 Kilodalton groß und das Hauptprotein, das in viralen Ribonukleoprotein-Komplexen vorkommt. Daher ist das NP-Band im Allgemeinen das stärkste Band in den Fraktionen, die die VRNPs enthalten. Im nächsten Teil werden wir diese VRNP-Fraktionen anreichern.

Kombinieren Sie die Glycerinfraktionen, die hauptsächlich NP enthalten, und verteilen Sie sie auf zwei Beckman-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit den Maßen 11 Millimeter mal 34 Millimeter. Füllen Sie jedes Röhrchen mit Ethylpyrokarbonat oder DEPC-behandeltem ultrareinem Wasser. Pipettieren Sie dann mehrmals auf und ab, um die Lösung zu mischen. Stellen Sie die Röhrchen in einen Beckman-TLA-1-20,2-Rotor und zentrifugieren Sie vier einhalb Stunden bei 157.000 × g und vier Grad Celsius.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet. In 50 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser aliquotieren Sie das gereinigte V-NPS, stellen Sie eine Aliquotte beiseite und lagern Sie die anderen bei minus 80 Grad Celsius. Nun sind wir bereit, mit der negativen Färbung der VRPs fortzufahren.

Verdünnen Sie ein Mikroliter gereinigtes VRNP in neun Mikrolitern frisch hergestelltem und zweifach filtriertem PBS-Puffer. Glimmentladen Sie 30 Sekunden lang ein Kupfer-TEM-Präparatgitter, das zuvor mit einem Parlow-Dion- und Kohlenstofffilm beschichtet wurde. Halten Sie das frisch glimmentladene Präparatgitter mit einer Pinzette und geben Sie einen Tropfen von fünf Mikrolitern verdünntem VRNP auf das Präparatgitter.

Lassen Sie den Tropfen acht Minuten lang auf das Raster einwirken. Legen Sie einen kleinen Streifen Parfum in eine Schale und geben Sie darauf zwei Tropfen mit jeweils 10 Mikroliter PBS-Puffer sowie einen 80-Mikroliter-Tropfen der frisch hergestellten Färbelösung, die aus 1 % Ammoniummellitat besteht. Waschen Sie nun das Probengitter, indem Sie es vorsichtig für insgesamt eine Minute in die beiden PBS-Tropfen senken.

Verwenden Sie dann ein Stück Filterpapier, um einen Teil der Probelösung vom Probenträger abzuziehen, ohne dass der Probenträger austrocknet. Unmittelbar nach dem Abziehen des letzten Tropfens Puffer vom Probenträger wird der Probenträger vollständig in den Farblösungstropfen eingetaucht. Warten Sie anschließend eine Minute.

Nach einer Minute ein neues Stück Filterpapier verwenden, um die Färbelösung vollständig vom Probenträger abzusaugen. Den Probenträger vor der Beobachtung mehrere Minuten lufttrocknen lassen. Unter einem Transmissionselektronenmikroskop sind hier repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie-Aufnahmen von negativ gefärbten V-NPs zu sehen.

Wie hier zu sehen ist, ähneln die V-NPS stabförmigen Partikeln mit variabler Länge, die etwa 30 Nanometer bis 120 Nanometer lang sind. Das oligomere NP ist als Kette aus NP-Molekülen organisiert, die weiter zu einer doppelhelikalen Wiederholungsstruktur gefaltet ist. Daher können an beiden Enden dieser stabförmigen Partikel gelegentlich Schleifen beobachtet werden.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Influenza- und virale Ribonukleoprotein-Komplexe reinigt und visualisiert. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, beim Verdünnen der VR-MPs kein PBS zu verwenden, wenn Sie Uranylacetat für die negative Färbung nutzen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.