Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting für Kultur-unabhängige Identifizierung von gelöstem organischem Kohlenstoff abbauenden Bakterioplankton

Mikroben vermitteln den Abbau zahlreicher gelöster organischer Kohlenstoffsubstrate oder DOC-Verbindungen, wie beispielsweise in Racine und aquatischen Umgebungen. Um die Rolle von Mikroben bei der DOC-Transformation vollständig zu verstehen, ist eine gleichzeitige Identifizierung ihrer Taxonomie und Funktion erforderlich. Dieses Video zeigt ein Verfahren zur taxonomischen Identifizierung frei lebender Bakterien oder bakterieller Planktonarten, die spezifische DOC-Pools und aquatische Umgebungen umsetzen.

Wasserproben, die aus einer Testumgebung gesammelt wurden, werden aufgearbeitet und mit einer Substanz von Interesse sowie Bromodesoxyuridin (BRDU) inkubiert, das in neu synthetisierte DNA und aktiv wachsende Zellen eingebaut wird. Anschließend werden BRDU-markierte bakterielle Planktonorganismen mit ZI-konjugierten Anti-BRDU-Antikörpern markiert. Bakterielles Plankton mit hohen BRDU-Markierungsgraden wird mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung isoliert.

Die DNA wird anschließend aus den sortierten Zellen extrahiert, und die taxonomische Identifizierung erfolgt basierend auf den Ergebnissen einer PCR-basierten Analyse des 16S-ribosomalen RNA-Gens. Hallo, mein Name ist Steven Robbins aus dem Labor von Dr. Chen Mao am Department für Biowissenschaften der Kent State University. Heute werden Lu und ich Ihnen eine kulturunabhängige Methode zur Identifizierung von DOC-abbauenden bakteriellen Planktonorganismen in aquatischen Umgebungen vorstellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Nährstoffzugaben, gefolgt von der Analyse der bakteriellen Gemeinschafts-DNA, liegt darin, dass die Analyse auf hochaktive Bakterien fokussiert wird und inaktive sowie langsam wachsende Zellen ausgeschlossen werden. Hier zeigen wir die Identifizierung von Bakterien, die Bananenpflanzen nutzen, um eine spezifische DOC-Verbindung zu verwerten. Diese Methode kann jedoch auch angewendet werden, um Bakterienplankton zu untersuchen, das andere einzelne DOC-Verbindungen oder Gruppen von DLCs wie Algenexsudate nutzt.

Also lassen Sie uns einige Wasserproben entnehmen und beginnen. Bevor Wasserproben auf DOC-abbauende bakterielle Plankton untersucht werden, müssen die Wasserproben angemessen aufbereitet werden. Die hier gezeigten Proben wurden an der Küste von Georgia gesammelt, um große Partikel und ER VREs aus der Wasserprobe zu entfernen.

Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um Wasser aus dem Sammelkanister in eine Filtrationseinheit mit einem Filter der Porengröße von einem Mikrometer zu überführen. Anschließend werden 36 Milliliter-Aliquote des Filtrats in drei sterile 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführt, von denen jedes vier Milliliter frisch zubereitete 10 % Paraformaldehyd-Lösung enthält. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur, um die Zellen nach der Inkubation zu fixieren.

Geben Sie das Wasser in den Filtrationsturm einer Glas-Vakuumfiltrationsanlage mit weißen Membranfiltern der Porengröße 0,22 Mikrometer und setzen Sie das Vakuum auf, um die Lösung durchzusaugen. Spülen Sie den Filter, indem Sie 10 Milliliter PBS durch den Vakuumfilter leiten. Beschriften Sie die Filter als negative Kontrollen und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.

Um ein experimentelles Ökosystem oder Mikrokosmos einzurichten, füllen Sie sechs einliterige, vorher gespülte Glasflaschen mit jeweils 800 Milliliter der vorfiltrierten Wasserprobe. Geben Sie jedem Mikrokosmos BRDU bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikromolar hinzu. Drehen Sie die Flasche schnell von Hand, um sie zu mischen.

Jede Probe wird im Triplikat analysiert. Geben Sie daher in drei der Mikrokosmen die modellhafte DOC-Verbindung hinzu. Hier wird Reine in die Mikrokosmen in einer Endkonzentration von 100 Nanomolar zugegeben.

Dann fügen Sie den anderen drei Mikrokosmen steriles PBS hinzu. Diese dienen als Kontrollen ohne DOC. Stellen Sie alle Mikrokosmen in einen schwingenden Inkubator mit 100 U/min im Dunkeln bei der In-situ-Temperatur von 25 Grad Celsius. Die Zeitpunkte hierfür sind 0, 8, 16 und 24 Stunden.

Sammeln Sie 36 Milliliter aus jedem Mikrokosmos in einem sterilen 50-Milliliter-Polypropylenrohr, das vier Milliliter frisches 10 % Paraformaldehyd enthält, und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren. Danach filtrieren Sie die fixierten Zellen durch weiße Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern. Geben Sie 10 Milliliter PBS durch den Vakuumfilter, um Rückstände von PFA abzuwaschen.

Fahren Sie unmittelbar mit der INS-Situ-Immundetektion fort, oder lagern Sie die Filter bei minus 20 Grad Celsius, um die BRDU-Inkorporation in bakteriellen Plankton zu analysieren. Beginnen Sie damit, die Probenfilter bei Raumtemperatur zu behandeln, um die bakterielle Zellwand zu schädigen. Legen Sie den Filter auf eine Filtrationseinheit und pipettieren Sie dann ein Milliliter Lysozym-Lösung auf den Filter, um die Zellen zu bedecken; inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation wird ein Vakuum angelegt, um die Lösung zu entfernen. Sobald die Lösung durch die Membran geflossen ist, werden die Zellen gewaschen, indem 10 Milliliter PBS hinzugefügt und erneut ein Vakuum angelegt wird. Um die Zellwand weiter zu schädigen, wird anschließend ein Milliliter Proteinase-K-Lösung auf die Membran gegeben, sodass die Zellen bedeckt sind.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Mit PBS waschen, um einzelsträngige DNA zu erhalten. Einen Milliliter Exonuklease-Lösung hinzufügen, um die Zellen auf dem Filter zu bedecken.

Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation waschen Sie den Filter, indem Sie 10 Milliliter PBS durch den Vakuumfilter leiten. Schneiden Sie anschließend die Ränder des Filters ab, um den Bereich ohne Zellen zu entfernen.

Danach auf einer mit Alkohol gereinigten, trockenen Oberfläche mit einer sterilen Klinge den Filter in acht gleich große Stücke schneiden. Für jede Probe werden acht Inkubationskammern mit Rahmenabdichtung benötigt; jeweils ein Achtel des Filters mit der Probenoberseite nach oben in die zusammengesetzte Inkubationskammer mit Rahmenabdichtung geben. Sobald die Kammern zusammengesetzt sind, mit dem Roche Intu Cell-Proliferation-Kit-Flus die A-B-R-D-U-markierten Zellen ortsfest nachweisen.

Nach Abschluss der Standardverfahren entfernen Sie den Filterabschnitt aus der Inkubationskammer und legen ihn mit einem sterilen Skalpell auf eine sterile Oberfläche. Schneiden Sie den Filterabschnitt in kleine Stücke. Überführen Sie die Filterstücke in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 Milliliter PBS enthält, schließen Sie das Röhrchen fest und versiegeln Sie es mit Parafilm. Inkubieren Sie das Röhrchen anschließend 10 Minuten lang in einem schwingenden Inkubator bei 37 Grad Celsius und 200 U/min.

Nach der Inkubation das Röhrchen verschließen und bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Pipettieren Sie das SUP-Überstand in ein steriles 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen, das fünf Minuten lang andauert. Anschließend den Filter in PBS resuspendieren und die Vortex- und Inkubationsschritte jeweils zwei weitere Male wiederholen, wobei jedes Mal das Snat dem gleichen 15-Milliliter-Röhrchen für jede Probe hinzugefügt wird.

Bewahren Sie die resuspendierten Zellen bei vier Grad Celsius auf. Die Probe sollte innerhalb von zwei Tagen per Fax analysiert werden. Abschließend sortieren Sie die Zellen, um die Population mit hohem BRDU-Inkorporationsgrad zu erhalten.

Hier wird ein BD-Facs-Flusszytometer und die entsprechende Software verwendet. Nachdem die Zellen sortiert wurden, kann die BRDU-angereicherte Population untersucht werden, um ihre taxonomische Identität zu bestimmen. Um die 16S-ribosomalen RNA-Gene der sortierten Bakterien zu amplifizieren, werden PCR-Ansätze durchgeführt, bei denen die sortierten Zellen mittels Pipette auf einen weißen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm aufgetragen werden; anschließend wird die Vakuumpumpe eingeschaltet und mit einem sterilen Skalpell die zellfreien Ränder des Filters abgeschnitten.

Schneiden Sie den Filter für jede Bedingung in vier gleich große Stücke, geben Sie ein einzelnes Filterstück in jeweils drei PCR-Reaktionsgefäße, wobei die Zellen nach innen weisen. Geben Sie 45 µL PCR-gradiges Wasser hinzu. Lassen Sie den Filterabschnitt vollständig im Wasser versinken.

Fügen Sie anschließend zwei Roche illustra pure T ready-to-go-PCR-Kügelchen hinzu und wirbeln Sie kurz an, um das Auflösen der Kügelchen zu unterstützen. Geben Sie dann jeweils zwei Mikroliter der vorwärts- und rückwärtsgerichteten 16S-ribosomalen RNA-Gen-Primer hinzu.

Fügen Sie entweder ein Mikroliter BSA hinzu, um Amplifikationsinhibitoren zu binden, oder ein Mikroliter Wasser. Führen Sie die PCR-Amplifikation in einem Thermocycler durch. Ein Touchdown-PCR-Programm wird empfohlen, bei dem die Annealingtemperatur schrittweise von 62 auf 52 Grad Celsius um jeweils ein Grad Celsius pro Zyklus gesenkt wird, gefolgt von 15 Zyklen bei 52 Grad Celsius.

Bestätigen Sie die PCR-Amplifikation durch Elektrophorese in einem C aus Bromid-gefärbten 1 % Agarosegelen, schneiden Sie die PCR-Amplicons aus dem Gel aus und reinigen Sie sie mit einem KaiGen Cayo Quick Gel-Extraktionskit. Nach der PCR-Gelreinigung vereinigen Sie die Amplicons derselben Probe. Die gereinigten 16S-ribosomalen DNA-Amplicons sind nun bereit für eine Reihe molekularbiologischer Analysen.

Proben wurden von einer Küstenstelle in Georgia gesammelt und zur Untersuchung von Racine abbauenden Bakterien gemäß der in diesem Video beschriebenen Vorgehensweise aufbereitet. Racine ist eine Polyamor-Verbindung, die in marinen Umgebungen weit verbreitet vorkommt. Wie hier gezeigt, kann sie als Nähr- und Energiequelle für marine Bakterien dienen.

Die Faktorenanalyse der Proben zeigte, dass nach einer 24-stündigen Inkubation eine Bakteriengruppe mit höherer FXI-Fluoreszenzintensität, die positiv mit dem Ausmaß der BRDU-Inkorporierung korrelierte, in den mit Racine angereicherten Mikrokosmen entstand. Diese Zellen wurden als Zellen mit hoher BRDU-Inkorporation oder HI bezeichnet und sollten überwiegend Racine abbauende Bakterien enthalten. Kein hi.

Es wurden Zellen in den Kontrollen ohne Zugabe gefunden, die nur Zellen mit niedrigeren BRDU-Inkorporationsgraden enthielten, sogenannte lii-Zellen, von denen erwartet wurde, dass sie hauptsächlich bakteriellen Plankton enthielten, der nicht verwertet werden konnte. Hinzugefügte Racine-HI-Zellen wurden in getrennte Röhrchen sortiert und anschließend auf Membranfiltern gesammelt. Partielle 16S-ribosomale RNA-Gen-Amplicons wurden nach Filter-PCR erhalten und durch Gelelektrophorese bestätigt.

Nach der Sortierung können auch PCR-Amplifikationen funktioneller Gene durchgeführt werden, um die funktionelle Diversität unter den sortierten Zellen zu untersuchen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man funktionelle Bakterienzellen in aquatischen Umgebungen physikalisch trennen und identifizieren kann, indem man die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit der BRDU-Inkorporation kombiniert. Denken Sie daran, dass BIDU, Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe stets während dieses Verfahrens getragen werden sollten.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.