Zellspezifische Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Population zelltypspezifischer Protoplasten aus einem Blatt zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Pflanzen angebaut werden, die GFP in spezifischen Zelltypen des Blattes exprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, Blätter zu sammeln und Protoplasten mittels enzymatischer Verdauung zu erzeugen.

Anschließend werden die Protoplasten gefiltert und mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS sortiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Genauigkeit der Sortierung mittels Fluoreszenzmikroskopie zu überprüfen. Letztendlich können die sortierten Protoplasten für die Analyse zelltypspezifischer Genexpression, die proteomische Analyse oder die metabolische Profilierung verwendet werden.

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung wurde bisher erfolgreich für Wurzeln eingesetzt, jedoch nur begrenzt zur Isolierung von Blattzellen. Die Markierung mit GFP vor dieser Methode war aufgrund der Interferenz durch Chlorophyllfluoreszenz eingeschränkt. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da eine schnelle, aber sorgfältige Probenvorbereitung entscheidend ist, um umfangreiche physiologische Veränderungen, die während der Zellsortierung auftreten können, zu minimieren.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie nicht wissen, wie man den Zellsortierer einrichtet oder wie man eine korrekte Sortierung überprüft. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der pflanzlichen Systembiologie zu beantworten. Das Problem bei der Identifizierung von Genregulationsnetzwerken in komplexen mehrzelligen Organen wie einem Blatt besteht darin, dass verschiedene Zelltypen unterschiedliche Gengruppen exprimieren.

Diese genetischen Informationen gehen bei der Ernteanalyse eines gesamten Blattes verloren. Ich werde das Verfahren demonstrieren. Begleitet werde ich von Ellison As und Sanjeev Kuma, die in unserem Labor technische Unterstützung für diese Arbeit leisten. Füllen Sie zunächst eine runde Petrischale mit neun Zentimeter Durchmesser mit 20 Millilitern Lösung A, die Proto-Plasmolyse-Enzyme sowie Transkriptions- und RNA-Inhibitoren enthält.

Dann gewinnen Sie das gewünschte Blattmaterial für Proben, die mehr als ein einzelnes Blatt enthalten, wie hier gezeigt. Ordnen Sie die Blätter in einem Stapel von bis zu 15 Blättern an. Anschließend schneiden Sie die Blätter mit einer Rasierklinge in Streifen mit einer Breite von einem Millimeter.

Überführen Sie die Blattstreifen unverzüglich mit einer flachen Pinzette in die Petrischale, trennen Sie die Streifen vorsichtig voneinander und infiltrieren Sie die Proben anschließend zweimal unter Vakuum, jeweils fünf Minuten lang. Danach stellen Sie die Petrischale auf einen Rüttelapparat mit 90 U/min bei Raumtemperatur und inkubieren die Proben drei bis vier Stunden lang. Während der Inkubation trennen Sie die Blattstreifen im Halbstundenrhythmus mit der Pinzette voneinander.

Nach der Verdauung filtrieren Sie die Protoplastenlösung vorsichtig durch einen 70-Mikron-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Um die Blattstreifen zu entfernen, werden die Streifen zurückgehalten. Die Protoplasten passieren den Filter.

Verwenden Sie nun vier Milliliter Lösung A, um die Blattstreifen vorsichtig zu spülen, und sammeln Sie die Waschflüssigkeit im 50-Milliliter-Röhrchen. Überführen Sie dann die Protoplastensuspension in Rundbodengefäße und zentrifugieren Sie die Protoplasten fünf Minuten lang bei 300 × g und Raumtemperatur. Achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzuwirbeln, saugen Sie vorsichtig so viel wie möglich der überstehenden Flüssigkeit ab und waschen Sie anschließend die Protoplasten unter denselben Zentrifugierbedingungen mit fünf Millilitern Lösung A.

Entfernen Sie abschließend den supinen Schwimmschnitt und resuspendieren Sie die PROTOPLASTEN mit einer abgeschnittenen P-1000-Spitze in einem geeigneten Volumen Lösung A unmittelbar vor der Sortierung. Verwenden Sie eine unbenutzte P-1000-Spitze, um eventuelle Klumpen in der Protoplastenlösung aufzulösen. Dissociieren Sie die Zellen weiter, indem Sie die Protoplasten durch einen 50-Mikron-Fillon-Filter in ein Sammelröhrchen filtrieren.

Verdünnen Sie die Zellsuspension anschließend entsprechend, um ein Verstopfen der Zellentnahmedüse zu vermeiden. Nach der Ermittlung der optimalen Bedingungen für die Zellentnahme identifizieren Sie die GFP-positiven Proto-plus mittels eines 488-Nanometer-Argon-Lasers unter Verwendung des Signals aus dem 580/30-Bandpassfilter im Vergleich zum 530/40-Bandpassfilter. Beachten Sie, dass die GFP-positiven Protoplasten in der Population mit hohem 530- und niedrigem 580-Signal erscheinen.

Mit den nicht GFP-exprimierenden Protoplasten in der Population mit niedrigem 530- und niedrigem 580-Signal erscheinen abgestorbene oder sterbende Protoplasten sowie Zelltrümmer in der Population mit hohem 580-Signal. Zur Visualisierung der sortierten Protoplasten mittels Fluoreszenzmikroskopie sortieren Sie die Protoplasten direkt nach der Anreicherung in mindestens das Achtfache des Volumens von Lösung A. Die Protoplasten können nach Zentrifugation in das Achtfache des Volumens von Lösung A überführt und zur Visualisierung unter dem Fluoreszenzmikroskop gesammelt werden, um die Anreicherung zu überprüfen. Dieses erste Bild zeigt ein Beispiel für die Anreicherung der TP-382-Zelllinie, die GFP in den Spaltöffnungszellen exprimiert. Beispiele für die mit dieser Methode erzielten Ausbeuten, sowohl vor als auch nach Amplifikation, sind in dieser Tabelle zusammengefasst.

Mengen zwischen 500 Pikogramm und 50 Nanogramm sind ausreichend für die Amplifikation mittels des Ovation PICO WTA-Systems und anschließende Analysen durch quantitative PCR, Next-Generation-Sequenzierung oder Microarray. Diese nächste Bildreihe zeigt verschiedene Protoplastenzelllinien, die mit der zuvor beschriebenen Methode isoliert und sortiert wurden. Diese ersten Protoplasten stammten von KC 2 74, Blättern eines Querschnitts von KC 2 74.

Blatt zeigt, dass die GFP-Expression im Gefäßsystem stattfindet. Diese Protoplasten wurden aus KC 4 64-Blättern isoliert, und ein Querschnitt eines KC 4 64-Blattes zeigt, dass die GFP-Expression in der adaxialen Epidermis nachweisbar ist. Schließlich wurden diese Protoplasten aus TP 3 82-Blättern von TP 3 82-Pflanzen gewonnen.

Das GFP wird hier in den Spaltöffnungszellen exprimiert. Typische Fax-Aufnahmediagramme, die die Ergebnisse der 5 80 30 Nanometer im Vergleich zu den 5 30 40 Nanometer Bandpassfiltern veranschaulichen, sind dargestellt. Die dargestellten Sortiertore entsprechen denjenigen, die typischerweise während der Sortierung verwendet werden.

Das erste Streudiagramm von Kohle vier Blatt abstammenden Protoplasten, die in Abwesenheit von Inhibitoren proto-plastifiziert wurden, zeigt eine einzelne Population mit niedrigem 530- und niedrigem 580-Signal. Dagegen demonstriert dieses Streudiagramm von wildtypischen, aus Kohle vier Blatt gewonnenen Protoplasten, die in Gegenwart von Inhibitoren proto-plastifiziert wurden, die Verschiebung der 580-Fluoreszenz, die durch den durch die Inhibitoren verursachten Stress und die Färbung entsteht. Diese Streudiagramme stammen jeweils von Blatt-protoplasten der Linien KC sieben vier, KC 4 64 und TP 3 82.

Diese Proben wurden außerdem in Gegenwart von Inhibitoren fixiert, wodurch sichtbar wurde, dass das GFP in den Hoch-530-niedrig-580-Populationen enthalten war. Für diesen repräsentativen quantitativen PCR-Versuch wurden zunächst Proben für jeden Fraktionstyp gewonnen. Anschließend wurden die Proben mit dem Ovation PICO WTA System und mittels quantitativer PCR amplifiziert.

Es wurden spezifische Primer für GFP verwendet. Die angezeigten Werte sind die höchsten in Rot und die niedrigsten in Grün; Durchschnitts- oder Einzelwerte, unter Verwendung von Actin zwei als Referenzgen, sind durch die horizontalen gelben Balken gekennzeichnet. Die Ergebnisse bestätigen erneut die optischen Bewertungen des GFP-Zellgehalts in den sortierten Fraktionen.

Die Population mit hohem 530 und niedrigem 580 zeigte die höchsten messbaren GFP-Expressionswerte. Während die Population mit hohem 530 und hohem 580 etwa 1000-fach geringere GFP-Expression aufwies, wiesen die Populationen mit niedrigem 530 und niedrigem 580 sowie niedrigem 530 und hohem 580 niedrige GFP-Expressionswerte auf, die mit denen der Kontrollprobe des gesamten Blattes und der nicht sortierten Protoplasten vergleichbar waren. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie in vier bis fünf Stunden von der Pflanze bis zur sortierten Zellpopulation durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Zellsortierer ständig zu überwachen und gegebenenfalls neu zu kalibrieren, um die Sortiergenauigkeit aufrechtzuerhalten.

Diese Methode wurde gefunden. Andere Verfahren wie die Mikrostrahlanalyse können durchgeführt werden, um die Genexpressionsniveaus in verschiedenen Zelltypen zu vergleichen. Nachdem diese Technik nun entwickelt wurde, analysieren wir die Genexpression in spezifischen Blattzelltypen zu verschiedenen Entwicklungsstadien und werden dies mit Daten aus dem gesamten Blatt vergleichen, die im Rahmen des Agronomieprojekts gewonnen wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Zelltypen von Blättern mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung isoliert.