Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-

Testen von Proteinen. Proteinwechselwirkungen sind unverzichtbar für die Aufklärung der Proteinfunktion. Dieses Video stellt einen in-vitro-Protein-Protein-Bindungsassay vor, mit dem die Wechselwirkung zwischen einem membranständigen und immobilisierten Protein sowie einem löslichen Protein getestet werden kann.

Zunächst werden Fusionsproteine kloniert, exprimiert und extrahiert. Das markierte unlösliche Protein wird auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert und so behandelt, dass es in seine native Konformation zurückgefaltet wird. Anschließend wird die Membran mit markierten löslichen Proteinen inkubiert, und eine Immunblot-Analyse wird durchgeführt, um die Proteine nachzuweisen.

Wenn die markierten Proteine wechselwirken, werden sie durch das auf der Membran immobilisierte Protein gebunden, und das Signal der Immunblotting wird detektiert. Somit bietet dieser Test eine zuverlässige Methode, um die Interaktion zwischen einem unlöslichen Protein und einem in Lösung befindlichen Protein zu überprüfen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Verfahren wie dem GST-Pull-down besteht darin, dass man die Bindung zwischen unlöslichem und löslichem Protein zuverlässig in vitro bewerten kann.

Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, genetisch markierte Proteine zur Detektion herzustellen. Klonen Sie zunächst das Protein, das auf der Membran immobilisiert werden soll. Bezeichnen Sie dieses hier als pro Im (für immobilisiertes Protein) in einen Expressionsvektor, der einen großen Marker wie GST codiert. Der leere Expressionsvektor, der nur für den Marker kodiert, wird als negativer Kontrollstamm für das immobilisierte Protein verwendet und als pro IM nc bezeichnet.

Klonieren Sie anschließend das Protein, das als löslicher Sondenstoff verwendet wird, in einen Expressionsvektor, der einen anderen Marker kodiert, beispielsweise Strep-Zwei. Dies wird im Folgenden als Prosol (lösliches Protein) als negativer Kontrollklon bezeichnet. Klonieren Sie ein lösliches Protein als negative Kontrolle in denselben Expressionsvektor. Dies wird als Prosol NK (lösliches Protein, negative Kontrolle) bezeichnet.

Verwenden Sie anschließend ein Proteinausdruckssystem, wie beispielsweise ein coli- oder balo-Virus, um die markierten Proteine zu exprimieren. Das verwendete Expressionssystem sollte sorgfältig anhand der Anforderungen bezüglich posttranslationaler Modifikationen ausgewählt werden. Isolieren Sie die exprimierten Proteine aus dem gewählten Organismus. Für pro IM und pro I mnc Resus.

Suspendieren Sie die Zellen in SDS-PAGE-Lade-Puffer unter Zusatz eines Proteaseinhibitorcocktails. Anschließend kochen Sie die Zellen fünf Minuten lang und zentrifugieren sie, um den Niederschlag zu entfernen, um Prosol und prosol NC zu gewinnen. Verwenden Sie Standardverfahren. Das pro IMS kann unter denaturierenden Bedingungen gewonnen werden, da die Proteine nach ihrer Immobilisierung auf der Nitrocellulosemembran wieder gefaltet werden.

Prosol sollte jedoch extrahiert werden, um eine native Konformation zu gewährleisten, da sie dem Bindungspuffer hinzugefügt werden, nachdem die markierten Proteine extrahiert wurden. Bestimmen Sie die Konzentration der rekombinanten Proteine mithilfe einer Standardmethode, wie beispielsweise dem BioRad-Protein-Assay-Kit. Falls für den Assay ein Rohextrakt anstelle eines gereinigten Proteins verwendet wird.

Schätzen Sie die Konzentration des Proteins der Wahl durch Dichtometrie der entsprechenden Bande auf einem mit Kumasis gefärbten SDS-Polyacrylamidgel. Verwenden Sie bekannte Konzentrationen von BSA als Referenz. Erstellen Sie anschließend die Standardkurve basierend auf den Signalintensitäten, die mittels Dichtometrie für BSA gemessen wurden, und berechnen Sie die Menge an Protein im Rohextrakt.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, pro Iam und pro IAM NC auf der Membran zu immobilisieren. Geben Sie jeweils ein Mikrogramm der pro Iam- und pro IAM NC-Extrakte im Duplikat auf ein SDS-Polyacrylamidgel. Entfernen Sie nach der Elektrophorese das Gel vorsichtig von den Glasplatten und legen Sie es in 100 Milliliter Transferpuffer. Inkubieren Sie anschließend unter leichtem Rühren 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation eine Westernblot-Analyse durchführen, um die Proteine nach der Übertragung auf eine Nitrocellulose-Membran zu übertragen, damit die membrangebundenen Proteine sich neu falten können. Die Membran in 15 Milliliter Puffer A geben und unter leichtem Rühren inkubieren. Um restliches SDS zu entfernen, 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.

Nach der Inkubation die Membran vorsichtig aus dem Puffer entfernen. Anschließend die Membran in 25 Milliliter Denaturierungspuffer geben. Zwei Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.

Während der Inkubation wird die Nitrocellulosemembran trüb. Überführen Sie die Membran anschließend mit einer Pinzette in 25 Milliliter TBS und inkubieren Sie sie unter leichtem Rühren für fünf Minuten. In diesem Schritt kehrt die Membran zu ihrer ursprünglichen weißen Farbe zurück.

Als Nächstes überführen Sie die Membran in 25 Milliliter Bindungspuffer. Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren über Nacht. Danach wird das lösliche Protein verwendet, um die Membran auf das immobilisierte Protein zu untersuchen.

Zunächst bereiten Sie die Hybridisierungspuffer vor, indem Sie ein bis zehn Mikrogramm Prosol und Prosol NC in separaten Röhrchen mit je 10 Milliliter frischem Bindungspuffer verdünnen. Anschließend geben Sie den Puffer in eine Hybridisierungsfolie. Danach schneiden Sie die Membran in zwei Streifen, wobei beide Streifen pro IM und pro IAM nc enthalten.

Diese Membranen werden in den Hybridisierungspuffer gegeben. Überführen Sie jede Membran in die ProSol- oder ProSol-NC-Hybridisierungslösung und inkubieren Sie 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie die Membranen aus den Hybridisierungslösungen und waschen Sie sie dreimal je 15 Minuten in TBS.

Um Protein-Protein-Interaktionen sichtbar zu machen, blockieren Sie die Membran mit 2,5 % Magermilch in TBST für eine Stunde. Nach der Inkubation legen Sie die blockierten Membranen in die Primärantikörperlösung. Hier wird ein anti-Strep-II-polyklonaler Kaninchenantikörper verwendet.

Ansatz für eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren nach der Inkubation. Spülen Sie die Membranen mit 20 Milliliter TBST 15 Minuten lang und anschließend zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Danach geben Sie die Membranen in die mit HRP konjugierte sekundäre Antikörperlösung. Hier wird ein mit HRP konjugierter Antikörper gegen Kaninchen-IgG verwendet.

Einmal für eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Die Membranen nach der letzten Spülung in TBS mit 20 Milliliter TBST 15 Minuten lang und anschließend zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln wie zuvor waschen und danach die Protein-Protein-Interaktion mittels eines HRP-Chemilumineszenz-Substrats detektieren. Hier: Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.

HRP-Substrat wird nach dem Immundotting des Prosols verwendet. Spülen Sie die Membran mit TBST 15 Minuten lang und anschließend zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur. Danach erneut die Membranen mit dem primären Antikörper gegen das Tag für Pro bebrüten.

Im gefolgt von dem entsprechenden sekundären Antikörper. Visualisieren Sie PRO I und pro Im NNC durch Nachweis der Chemilumineszenz, um die Identität der Banden im Proteinmembran-Overlay-Assay zu bestätigen. Die Interaktion zwischen den Proteinen A und K sowie YFP und MP CYFP wurde in epidermalen Tabakzellen mit der in diesem Video beschriebenen Methode wie hier gezeigt untersucht.

Wenn die biomolekulare Fluoreszenzkomplementation bewertet wurde, wurde ein starkes YFP-Signal rekonstruiert. Dieses BFC-Signal reicherte sich in den Punta an der Zellperipherie an, was charakteristisch für Plasma de ist, da MP ein hochgradig unlösbares Protein ist. Bei Expression in Bakterien oder Pflanzen wurde der Protein-Membran-Overlay-Assay angewendet, um diese Interaktion zu validieren.

In-vitro-Proteinextrakte, die ein Mikrogramm GST-MP oder nicht fusioniertes GST enthielten, wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und anschließend elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Als diese Proiame mit löslichem annk-strep2-GST-MP sondiert wurden, zeigte nur GST-MP, nicht jedoch das nicht fusionierte GST, eine Bindung. Darüber hinaus wurde bei Sondierung derselben Pro-IMS mit einer无关en Pro-Saw-nc-IE-Arabidopsis-cytoplasmatischen, mit Strep2 markierten NADH-Kinase keine Bindung beobachtet, was die Spezifität der ANK-MP-Interaktion weiter belegt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die immobilisierten Proteine gemäß dem vorgestellten Protokoll ordnungsgemäß nachzufüllen.