Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

Dieses Protokoll nutzt die Wechselwirkung zwischen Poliovirus und Poliovirus, unter Verwendung von erkennenden Nanokörpern, um einen einfachen, quantitativen Affinitätsnachweis in der flüssigen Phase zu demonstrieren. Grundsätzlich werden magnetische Kügelchen mit Kobaltbeschichtung verwendet, um markierte Proteine sowie jegliche wechselwirkende, radioaktiv markierte Proteine anzureichern. Zunächst werden die markierten und getaggten Proteine gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert.

Dann fügen Sie magnetische Kügelchen hinzu, die das Tag erkennen, und trennen die gebundene Fraktion des markierten Proteins von der ungebundenen Fraktion mithilfe von Magneten. Anschließend messen Sie das Signal des im ungebundenen Bruchteil befindlichen markierten Proteins und bestimmen die Menge des darin enthaltenen markierten Proteins. Die Ergebnisse dieses Affinitätsassays in flüssiger Phase sind äußerst nützlich, wenn konformationsänderungsempfindliche Proteine analysiert werden.

Dieser Affinitäts-Erfassungs-Assay in der flüssigen Phase kann Einblicke in die Wechselwirkung zwischen Poliovirus, erkannten Nanokörpern und verschiedenen Poliovirus-Antigenen liefern. Die Methode kann ebenfalls auf andere Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet werden, vorausgesetzt, dass ein Protein markiert werden kann und das andere nachgewiesen werden kann. Erstmals kam uns die Idee zu dieser Methode, als wir daran interessiert waren, die Wechselwirkung zwischen Poliovirus, erkannten Nanokörpern und verschiedenen Poliovirus-Antigenen zu untersuchen.

Da das Poliovirus empfindlich gegenüber konformationellen Umwandlungen ist, wenn es an einer festen Oberfläche angebunden ist, ist der Einsatz von e LSA begrenzt. Daher sollte ein System in flüssiger Phase bevorzugt werden. Ein Beispiel für ein solches, in der Poliovirusforschung häufig verwendetes System in flüssiger Phase ist das Mikroprotein.

Ein Immunpräzipitationsassay. Obwohl dieser Test seine Anwendbarkeit bewiesen hat, erfordert er die kristallisierte Struktur eines herkömmlichen Antikörpers, die bei Nanokörpern fehlt. Diese Nanokörper, interessante und sehr stabile einheitliche Antikörper, können leicht mit unterschiedlichem Text modifiziert werden.

Der weit verbreitete He-Stack zeigt Affinität zu zweifach geladenen Ionen wie Nickel und Kobalt, die wiederum leicht auf magnetischen Kügelchen beschichtet werden können. Wir entwickelten daher einen einfachen, quantitativen Affinitätsnachweis basierend auf mit Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen.

Versetzen Sie den Bestand magnetischer Kügelchen durch Vortexen und übertragen Sie 10 µL für jede Probe in ein Gefäß. Pelletieren Sie die Kügelchen mithilfe eines Magneten. Entfernen Sie den klaren Überstand, um die Kügelchen zu waschen. Geben Sie 150 µL Bindungspuffer hinzu.

Die Perlen mithilfe eines Magneten gewinnen und das Überstand nach einer zweiten Waschung entfernen. Die Perlen erneut in 40 µL Bindungspuffer pro Probe zur Kontrolle suspendieren. Für die Hintergrundkontrolle in Probe eins einen gut vorbereiten, der keinen radioaktiv markierten Virus enthält, jedoch ein gleiches Volumen an Bindungspuffer als Kontrolle.

Probe zwei mit 100 % Radioaktivität. Geben Sie alle Komponenten in eine Vertiefung, ersetzen Sie jedoch das Nanokörper durch Bindungspuffer. Geben Sie nun 2000 Zerfälle pro Minute des mit S-35 markierten Poliovirus-Stamm Sieben, Typ eins, in einem Gesamtvolumen von 80 µL Bindungspuffer zu allen Proben hinzu.

Steuerung akzeptieren. Probe eins. Geben Sie 10 Mikroliter der Nanokörperverdünnung zu jeder Probe hinzu.

Gut 10 Sekunden lang auf einem Schüttler mischen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Danach 40 Mikroliter der gewaschenen magnetischen Beadsuspension hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren, die Beads mit einem Magneten pelletieren und das geklärte Überstandsupernatant in ein Reagenzglas überführen, um die Radioaktivität jeder Probe zu messen. Übertragen Sie 50 Mikroliter des Supernatants in ein Zählgefäß. Fügen Sie drei Milliliter Szintillationsflüssigkeit hinzu, mischen Sie gründlich und messen Sie in diesem Gerät.

Ziehen Sie die verwendeten magnetischen Perlen in einem Reagenzglas mit Wasser gegen und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang mit 500 × g. Entsorgen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in sechs Milliliter 0,5-molarer Natriumhydroxidlösung. Anschließend portionieren Sie die Suspension auf mehrere Reagenzgläser und inkubieren sie fünf Minuten lang in einem Ultraschallbad.

Nachdem die Pellets mit einem Magneten gesammelt und der Überstand entfernt wurde, fügen Sie je einem Milliliter einer 2 %igen SDS-Lösung zu jedem Röhrchen hinzu, anschließend vermischen Sie durch Vortexen und bedecken mit Aluminiumfolie für fünf Minuten. Sammeln Sie nun die Pellets. Geben Sie je einem Milliliter einer 0,2-molaren EDTA-Lösung mit pH 7 zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang in einem Ultraschallbad.

Sammeln Sie anschließend die Perlen, waschen Sie die Perlen dreimal mit je einem Milliliter Wasser, gefolgt von einem Milliliter 10-Millimolarer Kobaltchloridlösung. Setzen Sie die Röhrchen zehn Minuten lang auf einen Schüttler. Führen Sie danach die Abtrennung der Perlen am Magneten durch und resuspendieren Sie sie in einem Milliliter Bindungspuffer.

Zweimal mit einem Milliliter 20 % Ethanol waschen und die Perlen abschließend in ihrem ursprünglichen Volumen an 20 % Ethanol resuspendieren, um regenerierte Perlen in einer Konzentration von 40 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Korrigieren Sie die Hintergrundstrahlung, indem Sie eine Kontrolle einrichten. Probieren Sie eine Probe als 0-%-Strahlungswert und die zweite Kontrollprobe als 100-%-Strahlungswert.

Berechnen Sie nun für jede Probe den Prozentsatz der Radioaktivität im Überstand als Maß für die Gesamtfällung des radioaktiv markierten Virus durch das Nanokörper. Dieses Experiment bewertet die Affinität von PVSS 38 C und eines Antikörpers, der spezifisch für Poliovirus ist, unter Verwendung von drei verschiedenen Antigenen des Poliovirus: natives Antigen, erhitztes Antigen und 14-S-Subeinheiten. Interessanterweise nimmt die Radioaktivität im Überstand der Proben, die radioaktiv markierte 14-S-Subeinheiten enthalten, mit steigender Konzentration des Nanokörpers PVSS 38 C ab. Dies weist auf eine Zunahme der Menge an Poliovirus-14-S-Subeinheiten hin, die an den Nanokörper PVSS 38 C und indirekt an die magnetischen Perlen gebunden sind.

Da keine Affinität von pvs S 38 C für die N-antigenische und H-antigenische Form von Poliovirus beobachtet wird, erscheint das Nanobody spezifisch für die 14 s-Untereinheit von Poliovirus. Die Affinität des Nanobodies gegenüber seinen Antigenen, gemessen mit dieser Methode, ist spezifisch, da das nicht verwandte Nanobody NB eins keinerlei Reaktivität gegen die drei antigenischen Formen von Poliovirus zeigt.

Dieses System zeichnet sich durch eine hohe Reproduzierbarkeit aus, wie in dieser Dosis-Wirkungs-Kurve gezeigt, die an verschiedenen Tagen von unterschiedlichen Untersuchern erstellt wurde. Sobald man dieses zuverlässige Assay-Verfahren in flüssiger Phase mit Affinitätsanreicherung beherrscht, kann es innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, einschließlich der Wiederverwendung der Beats. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diesen Affinitätsanreicherungs-Assay in flüssiger Phase unter Verwendung magnetischer Beats anwendet, um die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen zu untersuchen, insbesondere dann, wenn Systeme auf fester Phase nicht eingesetzt werden können.