Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Hallo, ich bin Victor Chi und Doktorand im Chandy-Labor der Abteilung für Physiologie und Biophysik an der University of California Irvine. Heute werde ich Ihnen demonstrieren, wie man Paraffinschnitte mit dem A b, C-Kit von Vector Laboratories anfärbt. Dieses Verfahren umfasst das Entfernen des Paraffins und die Hydratation der Paraffinschnitte, die hitzeinduzierte Antigenrückgewinnung zur Freilegung der Antigene, die Blockade von Peroxidase und unspezifischer Proteinbindung, die Inkubation mit CD4- und Tyrosinhydroxylase-Antikörpern sowie sekundären Antikörpern und schließlich die Entwicklung und Eindeckung des Objektträgers.

Beginnen wir also. Da die Objektträger in Paraffin eingebettet sind, besteht der erste Schritt darin, die Objektträger zu entparaffinisieren. Dies erfolgt üblicherweise in einer Abzugshaube mithilfe von drei Gefäßen mit Xylol, wobei drei Waschschritte durchgeführt werden, die jeweils fünf Minuten dauern.

Die Objektträger werden anschließend in hundertprozentigen Ethanol gegeben. Sie werden bemerken, dass das Wachs auf den Objektträgern verschwunden ist, achten Sie jedoch darauf, die Objektträger nicht mit Handschuhen anzufassen, da das Xylol den Gummibestandteil der Handschuhe auflöst. Danach bringen Sie die Objektträger in hundertprozentigen Ethanol zurück ins Labor, wo sie eine Hydratationsgradientierung durchlaufen werden.

Hier werde ich mit Ihnen über das Hydrationsgradient, dem wir unsere Objektträger unterziehen, sprechen. Zunächst beginnt es mit zwei Bädern aus 100-prozentigem Ethanol. Danach überführen wir unsere Objektträger in zwei Bäder mit 95%igem Ethanol.

Dann überführen wir unsere Objektträger in ein Bad mit 70 % Ethanol und danach in ein Bad mit 50 % Ethanol. Anschließend überführen wir die Objektträger in 30 % Ethanol und zwei Minuten später in zweifach destilliertes Wasser. Nach der Behandlung mit zweifach destilliertem Wasser lassen wir den Objektträger in PBS stehen.

Jetzt zeige ich Ihnen, wie man die Objektträger in den Halterungen von einem Bad zum nächsten transportiert. Der erste Schritt besteht darin, mit dem Halter die Objektträger herauszuholen und vorsichtig abzukratzen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, sodass nicht zu viel Flüssigkeit in das nächste Bad übertragen wird. Danach tauchen Sie die Träger ein und warten zwei Minuten, bis die nächste Gradientenänderung erfolgt.

Sehr oft wird das Antigen beim Fixieren der Gewebe verdeckt, sodass der Antikörper nicht mehr daran binden kann. Ich werde Ihnen nun eine Methode zur hitzeinduzierten Antigenrückgewinnung mithilfe von Natriumcitrat zeigen. Hier befinden wir uns nun an der Mikrowelle, wo ich mein CD8-Antigen freilegen werde, das ich anschließend mittels Immunhistochemie nachzuweisen versuche.

Und hier werde ich meine Lösung hinzufügen und sie 15 Minuten lang in der Mikrowelle erhitzen. Wir werden also unser Natriumcitrat zusammen mit den Objektträgern 15 Minuten lang zum Kochen bringen, um sicherzustellen, dass die Objektträger nicht austrocknen. Wir werden die Objektträger beobachten und bei Überschäumen erneut mit Natriumcitrat auffüllen, um sicherzustellen, dass die Objektträger hydratisiert bleiben.

Bevor ich die Objektträger in das Natriumcitrat gebe, habe ich die Lösung bereits 45 Sekunden vorher vorgewärmt. Dann habe ich die Objektträger in das Natriumcitrat gegeben und erhitzte diese Lösung nun 15 Minuten lang zusammen mit den Objektträgern. Normalerweise beginnt die Lösung etwa zwei bis zweieinhalb Minuten nach Beginn des Kochvorgangs überzukochen.

An diesem Punkt halte ich an und ersetze das verlorene Natriumcitrat durch frisches Natriumcitrat. Nachdem das Natriumcitrat 15 Minuten lang gekocht wurde, nehmen wir unsere Objektträger und die Lösung heraus und kühlen sie ab. Am besten verschließen Sie den Objektträgerhalter, gießen die überschüssige Flüssigkeit ab und führen ihn unter fließendem kaltem Wasser, bis die Lösung im Behälter auf Raumtemperatur abgekühlt ist.

Und dies dauert normalerweise etwa 10 bis 15 Minuten. Nachdem wir unsere Objektträger aus dem Waschbecken entfernt haben, müssen wir die endogene Peroxidase-Aktivität in den Geweben blockieren. Dazu stellen wir eine Lösung aus Wasserstoffperoxid her, indem wir 30 %iges Wasserstoffperoxid verwenden und daraus eine 1 %ige Wasserstoffperoxid-Lösung ansetzen.

Und von hier aus übertrage ich die Objektträger direkt in die Wasserstoffperoxidlösung. Nun inkubieren wir die Objektträger 20 Minuten lang in Wasserstoffperoxid. Nach Ablauf dieser 20 Minuten, nach der Blockierung der endogenen Peroxidase, wasche ich das Wasserstoffperoxid mithilfe von PBS-Spülungen von den Objektträgern ab.

Ich werde nun meine Objektträger auf die Halterung übertragen und sie mit drei Waschungen à jeweils fünf Minuten spülen. Die Objektträger wurden hierfür rückseitig aneinandergelegt, um Kontakt mit anderen Objektträgern zu vermeiden, der das Gewebe beschädigen könnte. Ich schiebe die Objektträger einfach ab und ordne sie so an, dass das Gewebe keinesfalls mit dem Glas in Berührung kommen kann.

Hier überführen wir unsere Objektträger in PBS. Nach dem Waschen der Objektträger mit PBS blockieren wir nun die unspezifische Bindung von Proteinen mit einer Lösung aus 5 % BSA, 5 % Ziegenserum und 0,1 % Natriumazid. Wenn Sie mit Antikörpern aus Ziege arbeiten, sollten Sie das Ziegenserum durch Serum einer anderen Spezies ersetzen.

Im Moment werde ich die Objektträger einfach in unseren Objektträgerhalter geben und diesen mit unserer Lösung auffüllen. Normalerweise fülle ich ihn nur zur Hälfte, sodass das Volumen der Objektträger sicherstellt, dass die Gewebe vollständig untergetaucht sind. Wenn Sie die Objektträger in den Behälter legen, sollten Sie darauf achten, dass die Gewebeproben die Seitenwände des Behälters nicht berühren.

Drehen Sie also für den letzten Objektträger nach innen, damit das Gewebe den Behälter nicht berührt. Da ich meine Objektträger nun über Nacht blockiert habe, werde ich die überschüssige Blockierungslösung mit drei Waschungen à fünf Minuten in PBS entfernen. An dieser Stelle möchten wir mit flüssigem Blocker einen Kreis um unser Gewebe ziehen, um die Menge des verwendeten Antikörpers zu minimieren.

Wenn Sie sich keine Gedanken über die Einsparung von Antikörpern machen, können Sie die Objektträger immer in denselben Kammern inkubieren, in denen auch der Blockierungsschritt durchgeführt wurde. Ab diesem Punkt zeige ich Ihnen, wie wir mit flüssigem Blocker um unser Gewebe herum zeichnen. Zunächst entfernen wir überschüssige Flüssigkeit, wobei wir vorsichtig sind, das Gewebe nicht zu berühren.

Wischen Sie also an den Ecken entlang, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Achten Sie erneut sehr, sehr sorgfältig darauf, das Gewebe nicht zu berühren. Nehmen Sie die Flüssigkeitsblockier-Nadel, drücken Sie vorsichtig nach unten, um den Fluss in Gang zu setzen, und umkreisen Sie anschließend das Gewebe mit Ihrem Stift.

Lassen Sie den Flüssigkeitsblocker etwa 15 Sekunden trocknen. An diesem Punkt soll die primäre Antikörperlösung hinzugefügt werden. Decken Sie mit einer Pipette das Gewebe vollständig mit dem primären Antikörper ab und überführen Sie es in Ihre feuchtigkeitskontrollierte Kammer.

Daher verwenden wir ein Kim-Tuch, das mit etwas destilliertem Wasser in dieser Schachtel angefeuchtet wurde, um zu verhindern, dass das Objektträger während der Inkubation mit dem primären Antikörper austrocknet. Nachdem der primäre Antikörper nun eine Stunde lang inkubiert wurde, nehmen wir die Objektträger heraus und waschen den überschüssigen Antikörper mit PBS ab.

Nochmals, lassen Sie einfach die Flüssigkeit ablaufen und geben Sie die Probe in Ihre PBS-Spülung. Spülen Sie erneut dreimal für jeweils fünf Minuten. Nach diesen drei fünfenminütigen Spülungen fügen wir, genau wie beim primären Antikörper, den sekundären Antikörper zu unserem Gewebe hinzu.

Geben Sie nun gerade genug Volumen zu, um Ihr Gewebe zu bedecken, fügen Sie Ihren sekundären Antikörper hinzu, den wir verwenden: Ziegen-Anti-Kaninchen, und legen Sie Ihre Probe erneut in die feuchtigkeitskontrollierte Kammer. Wir verwenden einen sekundären Antikörper, der biotinyliertes Ziegen-Anti-Kaninchen ist, was unerlässlich ist, wenn Sie die ABC-Methode anwenden. Überführen Sie daher Ihre Probe in die feuchtigkeitskontrollierte Kammer und lassen Sie sie eine Stunde inkubieren.

Während die Sekundärantikörper inkubieren, müssen wir das ABC-Reagenz vorbereiten. Wir verwenden das A-B-C-Reagenz von Vector Laboratories aus dem Vector-Färbekit. Entnehmen Sie Reagenz A, spitzen Sie es an und lassen Sie es dreimal in 15 Milliliter PBS tropfen, wobei Sie darauf achten müssen, die Röhre nicht zu zusammendrücken, da die Tropfen exakt dosiert und von einer bestimmten Größe sein müssen.

Nachdem Ihr Sekundärantikörper etwa eine Stunde inkubiert wurde, nehmen Sie Ihre Objektträger und waschen sie erneut in PBS, genau wie zuvor nach der Inkubation mit dem Primärantikörper. Nach drei Waschschritten, die jeweils fünf Minuten dauern, überführen Sie Ihre Objektträger in diesen Behälter, in den Sie das A-B-C-Reagenz geben, das Sie 30 bis 45 Minuten zuvor vorbereitet haben. Sie geben also einfach das A-B-C-Reagenz hinzu, bedecken die Objektträger vollständig und lassen es weitere 30 bis 45 Minuten inkubieren.

Nachdem Ihre Objektträger etwa 3 bis 5 Minuten in A, B, C gestanden haben, sollten Sie die überschüssige A, B, C-Lösung abwaschen. Entfernen Sie dazu einfach Ihre Objektträger und geben Sie sie in Ihre PBS-Lösung. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal in PBS, jeweils fünf Minuten lang.

Während die Objektträger gewaschen werden, bereite ich das DAB-Peroxidase-Substrat von Vector Laboratories vor. Ich nehme den Puffer mit pH 7,5 und gebe zwei Tropfen davon hinzu. Danach nehme ich das DAB-Substrat-Reaktionsreagenz und füge ebenfalls zwei Tropfen davon hinzu.

Auch hier ist die Tropfengröße entscheidend, daher die Flasche nicht zusammendrücken, sondern die Tropfen einfach fallen lassen. Zwei Tropfen für Puffer pH 7,5. Geben Sie also vier Tropfen der DAB-Substratlösung hinzu, wobei auch diese einfach fallen gelassen werden sollen.

Sie möchten am Ende außerdem zwei Tropfen des Wasserstoffperoxid-Substratreagenz hinzufügen. So sollte die DAB-Substratreagenz-Mischung aussehen. Nun ist sie bereit, um auf die Objektträger aufgebracht zu werden. Entnehmen Sie Ihre Objektträger und lassen Sie das PBS einfach ablaufen.

Im Laufe der Zeit wird das DAB-Reagenz zunehmend braun. Daher sollten wir es zu diesem Zeitpunkt auf unsere Objektträger auftragen. Geben Sie eine ausreichende Menge an, um die Gewebeproben zu bedecken, und fügen Sie es direkt auf die Gewebeproben hinzu.

Nehmen Sie einfach das entsprechende Volumen und geben Sie es direkt auf Ihre Gewebeproben, wobei die Lösung wirken kann, bis die Gewebeproben im Laufe der Zeit dunkler werden. Nach Zugabe der DAB-Lösung können Sie in diesem Gehirnschnitt sehen, wo das Gewebe hier und hier braun wird. Die braune DAB-Anfärbung zeigt den Bereich, der dopaminerge Neurone des Mittelhirns enthält.

Nachdem Sie Ihre Objektträger zwischen zwei und zehn Minuten entwickelt haben, sollten Sie diese in eiskaltes Wasser geben, um die Reaktion zu stoppen. Lassen Sie dazu einfach die Lösung ablaufen und geben Sie die Objektträger direkt in das eiskalte Wasser. Nachdem Sie die Objektträger in das eiskalte Wasser eingetaucht haben, nehmen Sie das Bad zum Waschbecken und lassen etwa fünf Minuten lang kaltes Wasser hineinlaufen, um sicherzustellen, dass die gesamte DAB-Lösung aus dem Bad herausgespült wurde.

Wenn Sie also das Objektträgerpräparat in die Spülschale geben, achten Sie darauf, dass der Wasserstrahl das Gewebe nicht direkt trifft, sondern besser auf eine der Ecken trifft, sodass das Wasser einfach überlaufen kann, wodurch Ihre Gewebeproben durch den strömenden Wasserfluss nicht gestört werden. Nachdem Sie die Objektträger aus der Wäsche entfernt haben, soll ein Gegenfärbung durchgeführt werden. Warum könnte man eine Gegenfärbung wünschen?

Nun, ein Grund dafür ist, dass Sie möglicherweise die Struktur Ihres Gewebes sehen möchten. Ein weiterer Grund ist die Visualisierung aller Zellen. Für unsere Zwecke führen wir daher eine Gegengegenfärbung mit Hämatoxylin durch, das für die Kerne steht.

Wir nehmen also unsere Objektträger, entfernen die überschüssige Flüssigkeit und tauchen sie einmal in die Hämatin-Lösung ein. Danach nehmen wir sie heraus und geben sie direkt ins Wasser. Nachdem Sie Ihre Objektträger in Leitungswasser gegeben haben, sollten Sie sie unter fließendem Wasser spülen, wie zuvor bereits mit dem eiskalten Wasserbad.

Beim Hämatoyinwaschschritt lassen Sie es einfach unter fließendem Wasser laufen, bis das Wasser im Gefäß klar wird. Nachdem wir unsere kontragefärbten Präparate aus dem Wasser genommen haben, müssen wir unsere Präparate erneut dehydrieren. Dazu führen wir sie erneut durch unseren Ethanol-Gradienten, jedoch in umgekehrter Reihenfolge.

Das wäre also eine Wäsche mit entionisiertem Wasser, eine Wäsche mit 30%igem Ethanol, eine Wäsche mit 50%igem Ethanol, eine Wäsche mit 70%igem Ethanol, zwei Wäschen mit 95%igem Ethanol und zwei Wäschen mit 100%igem Ethanol, jeweils zwei Minuten lang. Entfernen Sie nun Ihre Objektträger, wischen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab und geben Sie sie direkt in Ihr 30%iges Ethanol, wobei sie zwei Minuten lang einwirken sollen. Nach der letzten Wäsche mit hundertprozentigem Ethanol bringen wir die Objektträger wieder in Xylol.

Nehmen Sie nun Ihre Objektträger erneut zur Hand, entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, und geben Sie die Objektträger in das erste Xylol für fünf Minuten. Es folgen also drei aufeinanderfolgende Xylol-Bäder, jeweils fünf Minuten lang. Jetzt sind wir bereit, unsere Objektträger zu deckeln.

Was ich normalerweise mache, ist Folgendes: Eine Minute bevor die Objektträger fertig sind, nehme ich meine Pasteurpipette und sauge die Pergament-Montagelösung auf. Ich lasse dies etwa eine Minute lang ruhen, bevor die Objektträger nach der letzten Xylol-Waschung herausgenommen werden. Dabei ist darauf zu achten, dass die Handschuhe nicht in Xylol getaucht oder damit benetzt werden. Entfernen Sie die Objektträger vorsichtig mit einer Pinzette, wobei Sie aufpassen, welche Seite das Gewebe enthält. Wischen Sie vorsichtig mit einem Kim-Tuch das überschüssige Xylol ab, wobei Sie das Gewebe nicht berühren dürfen; wischen Sie lediglich vorsichtig an den Ecken und Rändern, sodass der größte Teil des Xylols verdunsten kann. Wahrscheinlich können Sie an zwei Objektträgern arbeiten, bevor einer austrocknet.

Während Sie eine Objektträgerplatte abtrocknen, sollte die andere bereits bearbeitungsbereit sein. Sie müssen nun mit ihnen arbeiten, bevor sie vollständig austrocknen. Nehmen Sie daher Ihren Perimount und ziehen Sie eine dünne Linie neben Ihr Gewebe, wobei Sie darauf achten, das Gewebe nicht zu berühren.

Entfernen Sie das Perimount, indem Sie Ihr Deckglas nehmen. Bringen Sie es in einem Winkel von 45 Grad an und lassen Sie es nach unten biegen. Dann schieben Sie Ihr Deckglas, wobei Sie sicherstellen, dass das Perimount alle Gewebe bedeckt.

Dann legen Sie es ab und drücken Sie vorsichtig in der Mitte, um überschüssige Luftblasen zu entfernen. Lassen Sie es trocknen, während Sie an Ihrem zweiten Gewebe arbeiten – das ist die Zeit, um sich unsere Objektträger anzusehen, allerdings nicht wirklich. Daher müssen wir dem Permount über Nacht Zeit zum Trocknen lassen, bevor wir uns unsere Objektträger ansehen.

Andernfalls bilden sich unter dem Mikroskop Bläschen in der Dauereinbettung, und Sie beschädigen Ihre Probe. Hier sehen Sie unsere Gehirnschnitte nach der Färbung mit Chemikalien und einem gegen Tyrosinhydroxylase gerichteten Kaninchen-Polyklonalen Antikörper. Erneut zeigt die braune DAB-Färbung die Lokalisation der dopaminergen Neurone im Mittelhirn.

Die Hämatin-Gegenfärbung färbt alle Kerne in diesem Gewebe blau. Soeben habe ich Ihnen gezeigt, wie man Paraffin-eingebettete Schnitte mithilfe des ABC-Kits von Vector Laboratories anfärbt. Nun müssen Sie die Bedingungen entsprechend den Gewebetypen, die Sie einfärben, und den Antikörpern, die Sie verwenden, anpassen.

Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.