Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anwendung des Flex Station Three zur Untersuchung des pharmakologischen Profils des transienten Rezeptorpotentials oder des TRPA1-Kanals zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen, die TRPA1-Kanäle exprimieren, in 96-Well-Mikrotiterplatten vorbereitet werden.

Nachdem die Zellen in einem Mikroplattenwascher gewaschen wurden, werden sie mit dem kalziumsensitiven fluoreszierenden Farbstoff beladen. Fluoh 4:00 AM – eine Zellbeladungsphase – wird anschließend durch mehrere zusätzliche Waschschritte ergänzt. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Substanzplatte vorzubereiten, einschließlich eines Trip, eines Agonisten und eines putativen Trip, eines Antagonisten.

Im letzten Schritt werden die Softwareparameter für das Plattenlesen im Flex Station Three-System eingerichtet. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die Aktivierung von Trip A1 durch Fluorphonsäure sowie die Hemmung durch die antagonistische Verbindung A zeigen. Obwohl diese Methode Einblicke in Aktivierungsmechanismen von 21 durch Messung des Calciumeinstroms ermöglicht, kann sie ebenfalls zur Untersuchung der Funktionen anderer calciumpermeabler Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelter Rezeptoren unter Verwendung calciumsensitiver Frozen-Farbstoffe oder Maly-Potential-Farbstoffe angewendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der Kalzium-Bildgebung und der manuellen Patch-Mappe ist, dass diese zeitsparende Technik eine Hochdurchsatzanalyse der Funktion und Modulation von Kalziumformeln, Eisenkanälen und anderen Kalzium-mobilisierenden Rezeptoren ermöglicht. Vor Beginn dieses Protokolls sollten HEC-293-Zellen, die stabil mit Trip A1 transfiziert wurden, gemäß dem schriftlichen Protokoll auf eine Dichte von 70 bis 90 % kultiviert werden. Um mit der Zellvorbereitung für den Kalzium-Assay zu beginnen, beschichten Sie 96-Well-Platten, indem Sie jeweils 50 Mikroliter Poly-L-Ornithin in jedes Well pipettieren, und inkubieren Sie die Platten mindestens 15 Minuten lang bei 37 °C.

Nach der Inkubation die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochscher Salzlösung spülen. Nach Trypsinbehandlung die HEC 293-Zellen in die gewünschte Menge in ein steriles 15-Milliliter-Konizentglas überführen und zentrifugieren. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet.

In das DMEM-Kulturmedium, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum ergänzt wurde, je 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte geben. Mit einem Mehrkanalpipettierer arbeitend, die Platte mindestens 30 Minuten im Sicherheitswerkbank abstellen, bevor sie für 20 bis 44 Stunden in den befeuchteten Zellkulturinkubator gestellt wird. Zur Vorbereitung des Kalzium-Assays zuerst die Lösungen gemäß der schriftlichen Anleitung herstellen.

Nach der Zubereitung 10 Mikroliter einer einmillimolaren Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Lösung mit 10 Mikrolitern von F1 27 mischen und das gesamte Gemisch in fünf Milliliter FITC-Assaypuffer, der mit 0,1 % Rinderserumalbumin ergänzt ist, überführen.

Als Nächstes waschen Sie die in 96-Well-Platten kultivierten Zellen zweimal mit HBSS, jeweils 80 µL pro Well, unter Verwendung eines Mikroplattenwaschers. Nach dem Waschen geben Sie die Fluor-4-AM-Ladelösung mit 50 µL pro Well mittels Mehrkanalpipette hinzu und inkubieren die Platte eine Stunde lang bei 37 °C. Während der einstündigen Zellbeladungsphase bereiten Sie eine Serie von dreifach konzentrierten Lösungen des Agonisten, eine Serie von dreifach konzentrierten Lösungen des Antagonisten sowie ein großes Volumen einer 300 µM Agonistenlösung im Fluor-4-Assaypuffer mittels Pipette vor.

300 Mikroliter der verdünnten Verbindungslösungen in eine 96-Well-Verbindungsplatte geben. Ordnen Sie es so an, dass die serielle Verdünnung einer Verbindung sowie die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen nach Möglichkeit in derselben Spalte der Verbindungsplatte angeordnet sind. Da der Flexstation Three jeweils nur eine einzelne Spalte liest, pipettieren Sie als letzten Schritt der Zellvorbereitung 300 Mikroliter der 300 Mikromolar-Agonistenlösung benachbart zu jedem Well, das den Antagonisten enthält.

Waschen Sie die beladenen Zellen nach dem letzten Waschgang dreimal mit dem Fluorid-Puffer (Fluorid-Puffer) unter Verwendung des Mikroplattenwäschers. Lassen Sie 80 Mikroliter des Fluorid-Puffers in jedem Brunnen stehen. Um mit dem Plattenlesen zu beginnen, schalten Sie das Flex Station 3-System ein und rufen Sie die Software Soft Max Pro 5.2 auf.

Speichern Sie das Experiment mit einem neuen Dateinamen in der Einrichtung. Wählen Sie den Flex-Modus und geben Sie die Parameter zur Messung des Agonisten- und Antagonisten-Effekts gemäß dem schriftlichen Verfahren ein. Danach platzieren Sie eine neue Spitzenbox, die Verbindungstabelle und die Messplatte in die entsprechenden Halterungen der Flex-Station.Three.

Beginnen Sie das Plattenlesen, indem Sie im Soft Max Pro-Software auf die Schaltfläche „Read“ (Lesen) klicken. Der Flex Station Three liest eine Spalte nach der anderen und fügt Verbindungen zu den vorprogrammierten Zeitpunkten hinzu, ohne das Lesen zu unterbrechen. Sobald der Durchlauf abgeschlossen ist, können die experimentellen Daten direkt mit der Soft Max PRO-Software verarbeitet oder in jedes Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel kopiert und eingefügt werden.

Um die Daten zu analysieren, erzeugen Sie Konzentrations-Wirkungs-Kurven für den Trip, einen Agonisten, Flu-Phoneminsäure, und für die vermutete Trip-Antagonistenverbindung A unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate, wie in der schriftlichen Anleitung für Trip beschrieben. Trip A1 ist ein für Calcium permeabler Kationenkanal, dessen Aktivierung zu einem Calciumeinstrom führt, der mittels des calciumempfindlichen Farbstoffs Fluor-4 erfasst werden kann. Repräsentative Aufzeichnungen der zeitlichen Verläufe von Fluoreszenzänderungen in Reaktion auf eine Serie von Flu-Phoneminsäure- oder FFA-Konzentrationen sind bei höheren Konzentrationen dargestellt. FFA löst Fluoreszenzanstiege mit einer deutlich schnelleren Kinetik aus als bei niedrigeren Konzentrationen, obwohl die maximalen Fluoreszenzwerte ähnlich sind.

Um diese Unterschiede zu unterscheiden, wurde die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung durch Messung der Anfangsgeschwindigkeiten des Anstiegs der Fluoreszenz aufgestellt. Nach Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von FFA betrug die halbmaximale wirksame Konzentration von FFA 55,4 µM. Die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung der Hemmung der durch FFA hervorgerufenen Kalziumantwort durch einen putativen Trip-A1-Antagonisten, Verbindung A, ist ebenfalls dargestellt.

Eine Dosis verringerte unabhängig die Reaktion der Trip A one-Zellen auf FFA mit einer halbmaximalen hemmenden Konzentration von 4,3 µM. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die pharmakologischen Profile von Triple A one und verwandten Kanälen unter Verwendung der Flag Station Three untersucht.