Quantifizierung und Analyse der Bildung von HO-Endonuklease Stimulated chromosomalen Translokationen von Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die genetische Kontrolle der Translokationsbildung durch Einzelstrangbrüche in diploiden Sprosspilzzellen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem Kulturen zunächst mit Einzelkolonien eines bestimmten Genotyps beimpft und über Nacht gezüchtet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, durch Zugabe von Galactose zu den Kulturen die gleichzeitige Bildung von Doppelstrangbrüchen durch die Ho-Endonuklease an zwei Chromosomen zu induzieren.

Als Nächstes werden Verdünnungen dieser Kulturen auf selektiven und nicht-selektiven Medien ausplattiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Translokationsfrequenz durch Zählen der auf selektiven und nicht-selektiven Medien entstandenen Kolonien zu bestimmen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die den genetischen Einfluss auf die Translokationsbildung durch Einzelstrang, ein Knieen durch Veränderungen in der Häufigkeit der ho-stimulierten Translokationsbildung in Stämmen unterschiedlicher Genotypen, aufzeigen.

Die Implikationen dieser Technik betreffen die Folgen einer therapeutischen Strahlenexposition bei Krebspatienten, da DNA-Doppelstrangbrüche und Translokationsbildung die primären Konsequenzen dieser Behandlung sind. Um mit dem Verfahren zur Bestimmung der durch Ho induzierten Translokationsfrequenzen zu beginnen, impfen Sie 10 bis 20 unabhängige Ein-Milliliter-Kulturen des Y-Peak-Glycerol-Lactat-Mediums mit einzelnen Kolonien des gewünschten Genotyps an und inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 Grad Celsius auf einem Rotator. Wenn die Kulturen die gewünschte Zelldichte erreicht haben, geben Sie 20 % Galactose zu den Kulturen, um eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen. Die Galactose induziert die Expression der Ho-Endonuklease, die Doppelstrangbrüche am his3delta5'-Allel auf Chromosom drei und am his3delta3'-Allel auf Chromosom 15 verursacht. Inkubieren Sie vier Stunden bei 30 Grad Celsius auf einem Rotator.

Der nächste Schritt ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Eine sorgfältige Verdünnung und Ausplattierung der Kulturen ist unerlässlich. Wenn Sie Translokationsfrequenzen erhalten, die ausreichend reproduzierbar sind, um statistisch signifikante Vergleiche zwischen Stämmen unterschiedlichen Genotyps zu ermöglichen, plattieren Sie nach vier Stunden geeignete Verdünnungen der Kulturen auf Medium ohne Histidin sowie auf YPD, und zwar etwa 100 bis 200 Kolonien pro Platte. Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für zwei bis drei Tage.

Wenn Kolonien entstehen, kann die Translokationshäufigkeit bestimmt werden. Die Ausplattierungseffizienzen vor und nach der Induktion der Ho-Endonuklease-Expression zeigen an, ob das Vorhandensein oder Fehlen eines der beiden Translokationschromosomen die Überlebensfähigkeit nach DSB-Bildung beeinflusst. Dabei werden jeweils eine Kopie des Chromosoms 3 und des Chromosoms 15 fragmentiert, um die Ausplattierungseffizienzen vor der Induktion zu bestimmen.

Entnehmen Sie zunächst eine Aliquotte von Zellen aus jeder Übernachtkultur und bestimmen Sie die Zellanzahl durch Zählen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie anschließend geeignet, um etwa 100 bis 200 Zellen auf YPD zu pipettieren, und inkubieren Sie zwei bis drei Tage bei 30 °C, bis Kolonien sichtbar werden. Geben Sie 20 % Galactose zu den verbleibenden Kulturen, um eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen, und inkubieren Sie bei 30 °C für vier Stunden, um die Plattierungseffizienz nach Induktion zu bestimmen.

Entnehmen Sie nach vier Stunden Induktion eine Aliquotte der Zellen aus jeder Kultur und bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Impfen Sie etwa 100 bis 200 Zellen auf YPD-Platten aus, indem Sie eine geeignete Verdünnung verwenden, und inkubieren Sie diese zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien entstehen. Sobald Kolonien auf den Platten sichtbar sind, kann die Ausplattierungseffizienz bestimmt werden. Klonen, die eine vermutete Translokation tragen, können mittels Southern-Blot analysiert werden.

Dieses Verfahren verwendet genomische DNA, die aus einer einzelnen hiss-positiven rekombinanten Kolonie aus jedem unabhängigen Versuch gewonnen wurde, und verdaut etwa vier Mikrogramm jeder DNA-Probe mit dem Restriktionsendonuklease BAM H1. Die BAM H1-verdauten Fragmente werden auf einem 0,7 %igen Agarosegel getrennt und anschließend auf eine positiv geladene Nylonmembran übertragen. Die Membran wird mit einer mit P-32 markierten Sonde hybridisiert, die durch zufällige Primerung aus einem 1,8-Kilobasen-BMH1-Genomklon gewonnen wurde, der das HIS3-Gen enthält. DNA-Fragmente werden mittels Autoradiographie oder Phosphoimaging sichtbar gemacht. Eine alternative Methode zur Untersuchung mutmaßlicher translokationshaltiger Klone ist die Chromosomen-Karyotyp-Analyse.

Chromosomen werden zunächst aus ausgewählten hiss+-Rekombinanten in Agarose-Plugs präpariert und in einem 1 %igen Agarose-Gel mittels elektrischem Feld mit konturiertem, geklemmtem homogenem Feld (CHEF) bei 14 Grad Celsius getrennt. Die folgenden Parameter werden verwendet: erster Block – 14 Grad Celsius, Umschaltzeit von 72 Sekunden und 15 Stunden bei sechs Volt pro Zentimeter; zweiter Block – 14 Grad Celsius, Umschaltzeit von 122 Sekunden und 11 Stunden bei sechs Volt pro Zentimeter. Nach Abschluss der Elektrophorese werden die Chromosomen sichtbar gemacht, indem das Gel 30 Minuten lang mit Bromidlösung (AUM) gefärbt, anschließend mit UV-Licht bestrahlt und in destilliertem Wasser detektiert wird. Anschließend werden die Chromosomen durch Kapillarwirkung auf eine positiv geladene Membran übertragen.

Unter denaturierenden Bedingungen hybridisieren mit einem durch Random-Priming erzeugten, mit P-32 markierten Sondenproben, der aus einem 1,8 Kilobasen großen BamH1-BamH1-Genomklon stammt und das hiss-Drei-Gen enthält. Die Chromosomen werden mittels Autoradiographie oder Phosphoimaging sichtbar gemacht. Die Häufigkeit chromosomaler Translokationen kann berechnet werden, indem die Anzahl der histaminphototrophen Kolonien durch die Gesamtanzahl lebensfähiger Zellen geteilt wird, die durch Ausplattieren auf YPD bestimmt wird.

In diesem Beispiel beträgt die berechnete Rekombinationsfrequenz etwa 3 %. Der Assay zur Bestimmung der durch Ho induzierten Translokationsfrequenzen kann unter Verwendung von Stämmen unterschiedlicher Genotypen durchgeführt werden, um Unterschiede in der Fähigkeit zum Reparieren von Doppelstrangbrüchen mittels Einzelstrangreparatur zu vergleichen. Ein Anstieg, wie in diesem repräsentativen Diagramm gezeigt. Die Translokationsfrequenzen, die sowohl selektiv als auch nichtselektiv mit dem RAD51Δ-Null-Homozygoten erhalten wurden, unterschieden sich statistisch signifikant von denen, die unter entsprechenden Bedingungen mit dem Wildtyp-Stamm vor und nach der Induktionsplättierung erzielt wurden.

Die Effizienzen werden bestimmt, indem die Gesamtzahl der lebensfähigen koloniebildenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellkörper in der Kultur geteilt wird, ermittelt mittels Hämozytometerzählung, wie in dieser Tabelle vor und nach der Induktionsplattierung gezeigt. Die Effizienzen unterschieden sich bei Wildtyp-Zellen nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein oder Fehlen eines der Translokationschromosomen die Überlebensfähigkeit nicht beeinflusst. DSB-Bildung.

Klone mit möglicher Translokation können mittels genomspezifischer Southern-Blot-Analyse untersucht werden. Hier ist eine grafische Darstellung der betroffenen Chromosomen vor und nach der Translokationsbildung gezeigt. Die Größen der Restriktionsfragmente, die durch BAM H ein-vermittelte Verdauung der genomischen DNA aus Stämmen der Ausgangs- und Rekombinantenstämme erzeugt werden und durch Hybridisierung mit einem 1,8 Kilobasen großen BAM H ein-Fragment auf Blots sichtbar gemacht werden, sind angegeben.

Seine drei genomischen Klone sind für die Southern-Blot-Analyse in Kilobasenpaaren angegeben. Genomische DNA wird mit dem Endonukleas BMH1 verdaut und mit einer mit P32 markierten 1,8-Kilobase-HIS3-Sonde hybridisiert, um diese diagnostischen Fragmente sichtbar zu machen.

0,8 Kilobasen HIS drei delta 201,7 Kilobasen hiss drei delta 3'-4 Kilobasen T 3 15 5 Kilobasen T 15 drei und acht Kilobasen hiss drei delta 5'-Fragmente. Lane A ist der parentale diploide Stamm. Lane B ist ein hiss-plus nicht-reziprokes Translokations-Rekombinanz, und Lane C ist ein his-plus reziprokes Translokationsprodukt.

Die rekombinante chromosomale BLO-Analyse kann ebenfalls verwendet werden, um Translokationen aufweisende Klone zu untersuchen. Intakte Chromosomen, die in Agarose-Plugs präpariert wurden, werden mittels CHEF-Elektrophorese getrennt und das Gel mit Iridiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die getrennten Chromosomen werden anschließend auf Nylon übertragen und mit dem P32-markierten 1,8-Kilobase-Fragment hybridisiert.

Sein drei-Probe-System dient zur Visualisierung des 1,1-Megabasen großen intakten Chromosoms 15, des 8-Megabasen großen T(15;3)-Translokationschromosoms, des 0,6-Megabasen großen T(3;15)-Translokationschromosoms und des 0,3-Megabasen großen intakten Chromosoms 3. Lane A zeigt den elterlichen Stamm. Lane B zeigt seinen Stamm plus einen nicht-reziproken Translokations-Rekombinanten, und Lane C zeigt seinen Stamm plus einen reziproken Translokations-Rekombinanten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Frequenz der Translokationsbildung nach mehreren, durch ho induzierten Doppelstrangbrüchen bestimmt werden kann.