Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, dynamische Veränderungen im Aktin-Zytoskelett lebender endothelialer Zellen zu beobachten. Transfizieren Sie zunächst humane endotheliale Nabelschnurvenen-Zellen mit einem GFP-Beta-Aktin-Plasmid und kultivieren Sie sie bis zur Konfluenz auf Deckgläsern. Anschließend platzieren Sie die Deckgläser in eine Kammer für die Live-Cell-Bildgebung mit einer beheizten Unterlage und einer Infusion aus einer physiologischen Albumin-Lösung.

Der letzte Schritt besteht in der Datenerfassung eines ausgewählten Zellbereichs mittels zeitraffenden Bildaufnahmen vor und nach der Behandlung mit einem pharmakologischen Wirkstoff. Eine Chime-Graph-Analyse mit Bildverarbeitungssoftware wie Image J kann Einblicke in lokale Lamellipodien-Protrusionen geben, beispielsweise hinsichtlich Distanz, Zeit und Geschwindigkeit der Ausstülpungen sowie der Bewegung von Aktinfilamenten über die Zeit. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der Immunfluoreszenz-Mikroskopie liegt darin, dass die Live-Cell-Abbildung die Einbeziehung der dynamischen Natur des Aktin-Zytoskeletts in Untersuchungen der Mechanismen ermöglicht, die die endotheliale Permeabilität bestimmen.

Während fixierte gefärbte Zellen Momentaufnahmen darstellen und nur geringe Informationen über die Dynamik des Aktins und des Cytoskeletts vor und nach der Behandlung mit einem entzündlichen Mediator liefern, arbeiten Sie in einem biologischen Sicherheitswerkbank. Sterilisieren Sie Deckgläser mit 70 %igem Ethanol für zwei Minuten und lassen Sie sie anschließend lufttrocknen. Legen Sie jedes Deckglas in eine 10 cm große Kulturplatte und geben Sie 300 Mikroliter warme Gelatine-Lösung in die Mitte, ohne die Ränder des Deckglases zu berühren. Nach fünf Minuten saugen Sie die Flüssigkeit ab.

Jetzt eine konfluente Kultur humaner Nabelvenenendothelzellen oder VE mit 0,25 % Trypsin-EDTA abernten. Die Zellen zählen und durch Zentrifugation pelletieren. So viel wie möglich vom SUP natum-Medium absaugen, um eine Transfektionsreaktion mit dem VE-Nukleareffektor-Kit durchzuführen.

Suspendieren Sie die Zellpellets in der grundlegenden nukleären Effektorlösung und geben Sie 0,2 bis zwei Mikrogramm des GFP-Beta-Aktin-Vektor-Plasmids hinzu. Überführen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in eine nukleäre Effektor-Qve. Klopfen Sie mehrmals leicht auf die abgedeckte Vete, um sicherzustellen, dass keine Blasen zwischen dem Boden der Qvet und der Transfektionsprobe vorhanden sind.

Platzieren Sie den Q VET in das nukleäre Effektor-Zwei-Gerät und führen Sie Programm A 0 3 4 aus, wobei Sie eine Transferpipette aus dem nukleären Effektor-Kit verwenden, um eine erwärmte Viertelliterportion von 500 µL EGM zwei MV-Medien in den QVE zu überführen. Übertragen Sie danach das Gemisch zurück in das Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang. Mischen Sie die transfizierte VE-Suspension vorsichtig einmal um und pipettieren Sie 300 µL der Suspension auf einen mit Gelatine beschichteten Deckgläser, wobei Sie die Ränder nicht berühren.

Anschließend eine bis vier Stunden inkubieren. Die transfizierten Zellen untersuchen, um die Anheftung an die Deckfolie zu bestätigen. Danach 10 Milliliter E GM zwei MV-Medium der Platte zugeben und die Inkubation für die GFP-Aktivitätsexpression fortsetzen.

Fügen Sie zunächst ein physiologisches Salzlösungsmedium mit Albumin oder ein PSS in das Schwerkraftdurchflusssystem ein und verbinden Sie es mit dem Inline-Heizer. Stellen Sie nun den Durchflussregler so ein, dass ein Durchfluss von etwa 40 Milliliter pro Stunde erreicht wird. Stoppen Sie anschließend den Durchfluss, indem Sie den Hahn mit einem mit Watte abgeschlossenen Applikator schließen.

Tragen Sie Vakuumfett auf die Außenkante der Unterseite des Diamantbades auf. Entnehmen Sie nun eine transfizierte Kultur aus dem Inkubator. Heben Sie die Deckglasabdeckung vorsichtig mit einer Pinzette an.

Dann mit einem Kim-Tuch überschüssiges EGM zwei MV-Medium auf der Unterseite des Objektträgers aufnehmen, wobei die Zelle nach oben zeigt. Legen Sie das Diamantbad über die Deckglasabdeckung, um eine Kammer zu bilden. Stellen Sie die Kammer schnell in den Objekttischheizer.

Ziehen Sie die Klemmen über der Kammer fest und pipettieren Sie etwa ein Milliliter EGM-2-MV-Medium von der Platte in die Kammer. Bringen Sie nun den Vakuumschlauch an der Halterung auf der linken Seite der Kammer und die PSS-Zuleitung von dem Inline-Heizgerät in den Kanal auf der rechten Seite der Kammer an. Schalten Sie danach das Vakuum ein und öffnen Sie die PSS-Zuleitung, um die Badperfusion über die transfizierten Zellen zu ermöglichen.

Schalten Sie außerdem die Inline-Heizung auf 37 Grad Celsius ein. Platzieren Sie als Nächstes die Thermistorsonde für die beheizte Plattform am Rand in das Bad und schalten Sie die Plattformheizung auf 37 Grad Celsius ein. Um verbleibende EGM-two-MV-Medien und Ablagerungen zu entfernen, wischen Sie die Unterseite der Deckglaskappe vorsichtig mit einem mit 70 %igem Ethanol getränkten Kim-Wipe ab, gefolgt von einem trockenen Kim-Wipe. Äquilibrieren Sie die transfizierten HU-Zellen für 30 Minuten.

Verriegeln Sie die Grobverstellung. Fokussieren Sie den ausgewählten Bereich der Kulturzellen zur Untersuchung. Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera je nach Intensität des GFP-Akt-Signals in den Zellen zwischen 0,5 und zwei Sekunden ein.

Stellen Sie außerdem die Intervall- und Dauerzeiten für das Experiment ein. Machen Sie nun bei ausgeschaltetem Raumlicht ein Einzelbild, um die Einstellungen zu überprüfen. Erfassen Sie die Zeitrafferserie, wobei die Bilder nach Bedarf überwacht werden.

Bei einem typischen Protokoll werden 20 bis 30 Minuten Basislinienbilder aufgezeichnet, bevor ein Testagent hinzugefügt wird, gefolgt von 0,5 bis vier Stunden weiterer Bildaufnahme. Abschließend werden, wie im begleitenden Text beschrieben, die Ausbildung von Lamellipodien, deren Ausdehnung, Persistenz und Geschwindigkeit mittels CH-Graph-Analyse bewertet. In einem typischen Experiment wird GFP-Aktin in über 50 % der transfizierten VE zufällig exprimiert.

Diese einmal pro Minute aufgenommenen Bilder erfassen GFP-Aktin im gesamten Zytoplasma sowie in filamentösen Strukturen und in lokalen Lamellipodien, die entlang des Zellrands hervortreten. Die Wegunabhängigkeit und Geschwindigkeit von Zellfortsätzen werden aus den Zeitrafferaufnahmen quantifiziert. Bei der Auswertung mit der chm-Grafikanalyse wird zunächst eine einpixelige Linie annähernd senkrecht zum Zellrand gezogen.

Dieser Bereich wird aus jedem Bild des Zeitraffersatzes extrahiert, um eine Montage des Bereichs im zeitlichen Verlauf zu erzeugen, oder hier einen Klanggraphen, der aus einer von links nach rechts verlaufenden Perspektive im Klanggraphen dargestellt wird, wobei Ausstülpungen als Aufwärtsbewegungen am Zellrand dargestellt werden. Wenn eine Linie über den Rand einer dieser Ausstülpungen gelegt wird, können die mit dieser Linie assoziierten Pixeldaten erfasst werden, um die Dynamik der Ausstülpungen zu quantifizieren. Die Gesamtanzahl der Ausstülpungen in einem Klanggraphen kann verwendet werden, um die Frequenz der Ausstülpungen abzuschätzen.

Diese Analyse zeigt die Bewegungen von Stressfasern, die sich in der Nähe des Zellrandes bilden und sich in Richtung Zellzentrum bewegen, wo sie schließlich zerlegt werden. Auf dem Chio-Diagramm erscheinen die Stressfasern als kontinuierliche Linien im zytoplasmatischen Bereich, die sich häufig nach unten und rechts in Richtung Zellzentrum bewegen. Sind die Fasern im ursprünglichen Chio-Diagramm schwer erkennbar, schärft der Unschärfemaske-Filter die Bildlinien. Eingezeichnete Linien entlang der Stressfasern erleichtern die Erfassung der Pixeldaten mithilfe der Messfunktion. Alternativ werden Linien vom Anfang bis zum Ende der identifizierten Stressfaser gezogen, um über die gesamte Beobachtungsdauer der Faser eine massengewichtete Durchschnittsauswertung der Pixeldaten zu erhalten.

Diese Darstellung zeigte, wie man Daten aus dem Zeitrafferbildsatz mithilfe der Graphanalyse mit Software wie Image J analysiert. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts als Reaktion auf entzündliche Mediatoren mittels Live-Cell-Imaging transfizierter endothelialer Zellen untersucht.