PDMS Bauelementherstellung und Oberflächenmodifizierung

Mein Name ist Ken Kotz. Ich bin Postdoktorand am Bio MAs Resource Center, das mit dem Massachusetts General Hospital verbunden ist. Mein Hauptforschungsprojekt beinhaltet die Isolierung von Neutrophilen mittels einer immunoaffinitiven Gewinnungsvorrichtung mit mikrofluidischen Strukturen.

Wir verwenden dieses Gerät in fünf verschiedenen Krankenhäusern im ganzen Land, um RNA für die nachgeschaltete genomische Analyse zu isolieren. Grundsätzlich liegt eine Masterstruktur aus SU-8-Photoresist auf einem Siliziumträger vor. Wir werden ein zweikomponentiges Elastomer, A-P-D-M-S, auf diese Masterstruktur gießen, und dieses PDMS bildet dann eine Form.

Wir nehmen die Urform aus ihrer Halterung und legen sie in eine Petrischale. Die Urform wird mit Klebeband an der Unterseite der Petrischale befestigt. Auf der Waage wiegen wir eine Mischung aus PDMS, Härter und Basisharz ab.

Das Verhältnis beträgt ein Teil Härter zu zehn Teilen Harz. Üblicherweise wiegen wir für unsere ausgeschnittenen Vorrichtungen 20 bis 30 Gramm Harz und entsprechend zwei bis drei Gramm Härter ab. Nachdem sowohl der Härter als auch das Harz in das kleine Pelethäuschen gegeben wurden, mischen wir beide Komponenten mit einer handelsüblichen Kunststoffgabel miteinander.

Sie sollten sicherstellen, dass Sie kräftig mischen und die Masse ineinanderfalten, um eine gleichmäßige Verteilung des Härtemittels im Harz zu gewährleisten. Üblicherweise überwachen wir, wie gut die beiden Komponenten vermischt wurden. Anhand der Anzahl der Luftblasen versuchen wir, eine gleichmäßige Verteilung kleiner Luftblasen im gesamten Elastomer zu erreichen.

Anschließend gießen wir das PDMS auf die SU-8-Matrize, die sich in der Petrischale befindet. Wir stellen die Matrize mit dem darauf befindlichen PDMS in ein Vakuumglockengefäß und evakuieren die Kammer, um die eingebrachte Luft zu entfernen. Typischerweise dauert der Entlüftungsprozess 30 Minuten bis eine Stunde.

Nach der Entgasung nehmen wir die Geräte aus der Vakuumkammer und stellen sie in einen Ofen bei 65 bis 80 Grad C. Die minimale Aushärtezeit bei diesen Temperaturen beträgt drei bis sechs Stunden. In unserem Labor lassen wir die Geräte üblicherweise über Nacht im Ofen.

Üblicherweise verwenden wir ein chirurgisches Skalpell aus rostfreiem Stahl der Größe 11. Wir führen gerade Schnitte etwa einen halben Zentimeter tief von der Kante des Silikon-Abdrucks aus und schneiden entlang der Kante des Abdrucks, um eine große Scheibe zu erhalten. Wir lösen die PDMS-Form vorsichtig vom Abdruck und legen sie mit der strukturierten Seite nach oben in eine saubere Petrischale.

Wir nehmen die freigelegte Form aus der Petrischale und platzieren sie mithilfe eines Messers oder eines auf einer linearen Führung befestigten Messers auf einer Schneidoberfläche. Wir schneiden die auf der Form enthaltenen Geräte ein. Jedes segmentierte Gerät wird anschließend zur weiteren Verarbeitung wieder in die Petrischale zurückgelegt.

Üblicherweise stanzen wir Löcher in das PDMS-Gerät, um unsere Geräte mit Flüssigkeiten zu verbinden. Zum Stanzen der Löcher verwenden wir eine Standard-3-Milliliter-Spritze. An der Spitze der 3-Milliliter-Spritze befindet sich eine stumpfe Nadel aus rostfreiem Stahl.

Innerhalb der Edelstahlnadel befindet sich ein Draht, der genau in den Innendurchmesser der Nadel passt. Dieser Draht ist mit dem Kolben der Spritze verbunden. Indem man den Kolben zurückzieht und dabei die Nadel zurückzieht, kann man ein Loch oder einen Stecker in das PDMS stanzen. Wenden Sie das PDMS-Gerät und stoßen Sie es aus, indem Sie den Kolben nach vorne drücken.

Das Geheimnis beim Einsatz von Lochstanzgeräten besteht darin, den Kolben so vertikal wie möglich zu halten und das Stanzgerät keinesfalls zu drehen. Nachdem Sie durch das PDMS gestanzt haben, heben Sie das gesamte Gerät, also das komplette PDMS-Gerät, mit einer Pinzette an, drehen es um und drücken den entstandenen Pfropfen durch Herunterdrücken des Kolbens heraus. Anschließend greifen Sie den Pfropfen mit einer Pinzette und entsorgen ihn.

Dann ziehen Sie den Kolben erneut zurück, drehen das Gerät wieder nach unten und ziehen das Schneidwerkzeug heraus. Wiederholen Sie dies, bis alle Löcher gestanzt sind. Für den Bonding-Prozess binden wir unsere PDMS-Geräte an Objektträger aus Glas.

Für unsere Vorrichtungen werden wir das PDMS nicht reversibel oder kovalent an Glasobjektträger binden. Dies wird erreicht, indem die Proben in einen Plasma-Ätzer gegeben und einem reaktiven Sauerstoffplasma ausgesetzt werden. Die Schritte hierfür sind, das PDMS-Gerät zu nehmen und es auf das Tablett des Plasma-Ätzers zu legen.

Bei nach oben weisenden Geräteelementen können Sie jeden handelsüblichen Glasobjektträger verwenden. Wir verwenden einen leicht vergrößerten Objektträger mit einer Länge von eineinhalb Zoll, um unser Gerät darauf unterzubringen. Sie können die Objektträger direkt aus der Verpackung heraus verwenden.

Wir bevorzugen eine Behandlung in einer Piranha-Lösung. Dadurch werden alle organischen Verunreinigungen, die auf der Oberfläche des Objektträgers vorhanden sein könnten, entfernt. Nachdem Sie das Gerät und den Objektträger auf das Tablett für den Plasma-Asher gelegt haben, schieben Sie das Tablett in den Plasma-Asher und setzen es dem reaktiven Sauerstoffplasma aus.

Nach Abschluss des Programms des Plasma-Ashers öffnen wir die Kammer und nehmen die Platte mit unseren Geräten auf die Laborbank. Mit einer Pinzette heben wir das PDMS-Gerät vorsichtig an, wobei wir darauf achten, die Bondflächen nicht mit den Fingern zu berühren. Wir drehen die Bondseite um und legen sie auf die Glasobjektträgerfläche, und stellen dann sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen dem PDMS und dem Glasobjektträger befinden.

Wir stellen das nun mit dem Glas verbundene PDMS-Gerät auf eine Heizplatte bei 65 bis 75 °C für 10 Minuten, um eine bessere chemische Bindung zu erzielen. In diesem Abschnitt werden wir die Oberflächen des PDMS auf dem Glas chemisch modifizieren, nachdem die Verbindung im Reinraum erfolgt ist. Danach verbleibt eine PMS-Oberfläche, die reaktive OL-Gruppen auf der Oberfläche aufweist. Diese reaktive Oberfläche ist hydrophil und wird schließlich in das Innere des PMS diffundieren.

Die Oberflächenchemie sollte daher am besten unmittelbar nach der Plasmabehandlung durchgeführt werden. Wir verwenden eine 5%ige Lösung eines Mercaptoalkohols, nämlich 3-Mercaptopropyl-trimethoxysilan. Es handelt sich um eine 5%ige Volumenlösung. Im Wesentlichen injizieren wir diese in den Eingang und stellen sicher, dass das Gerät vollständig und ohne Luftblasen gefüllt wird.

Falls Luftblasen vorhanden sind, entfernen Sie diese mit einer Pinzette. Danach, sobald Sie das Slan injiziert haben, lassen Sie es 15 bis 30 Minuten lang stehen. Bei Raumtemperatur injizieren wir typischerweise eine zweite Menge des Slan zehn Minuten nach Reaktionsbeginn.

Nachdem die Reaktion des Cylin etwa eine halbe Stunde lang stattgefunden hat, spülen wir alle Vorrichtungen mit drei bis vier Gerätevolumina reinem Ethanol durch. Den überschüssigen Ethanol, den wir ausstoßen, wischen wir einfach mit einem Chemiewisch ab. Nach dem Spülen nehmen wir die Vorrichtungen auf und legen sie auf eine Heizplatte, die auf hundert Grad Celsius eingestellt ist, und lassen im Wesentlichen das darin enthaltene Ethanol verdampfen. Dies hilft, die Siling-Oberfläche zu reinigen.

Nachdem das Gerät getrocknet ist, kann es monatelang in einem Trockenbehälter aufbewahrt werden, oder Sie können das Gerät nehmen und unmittelbar mit dem nächsten Schritt fortfahren. Nachdem die Geräte ausgehärtet sind, weisen sie eine Silylbeschichtung auf beiden Oberflächen – der Glas- und der PDMS-Oberfläche – auf. Der Silylreagenz ist ein kapto-silylisierter Reagenz mit einer Thiolgruppe, die mit unserem hetero-bifunktionellen Vernetzer GMBS reagieren wird.

Es wird in reinem Ethanol verdünnt. Es reagiert mit Wasser, daher ist darauf zu achten, es nicht wässrigen Bedingungen auszusetzen. Wir injizieren es in die Vorrichtungen und entfernen alle Luftblasen mit einer Pinzette, wie ich es hier tue, um sicherzustellen, dass alle Oberflächen mit diesem Molekül benetzt sind.

Wir decken es ab und lassen es eine halbe Stunde lang reagieren. Nachdem das GMBS eine halbe Stunde reagiert hat, spülen wir die Vorrichtungen mit entionisiertem Wasser, um Rückstände von Ethanol aus der Vorrichtung zu entfernen. Anschließend leiten wir Neu Travain durch, ein Biotin-bindendes Protein.

Das neutrale Travain wird dann auf eine Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter vorgedünnt. Falls versehentlich Luft in das Gerät eingespritzt wird, muss das Gerät erneut mit Ethanol durchgespült werden, um jegliche Luft effektiv zu entfernen. Ethanol benetzt die Oberflächen des Geräts besser und ermöglicht es, alle versehentlich eingeführten Luftblasen zu entfernen. Nachdem die Geräte mit ionisiertem Wasser durchgespült wurden, füllen wir das Gerät typischerweise mit zwei bis vier Gerätevolumina der verdünnten neutralen Travain-Lösung.

Der Nutt-Travain reagiert mit dem GMBS, das über primäre Methoden auf der Oberfläche des Nutt-Travains immobilisiert ist. Dieser Prozess kann eine Stunde lang bei Raumtemperatur ablaufen. Üblicherweise stelle ich die Geräte über Nacht bei vier Grad C in den Kühlschrank.

Bevor wir jedoch den Antikörper hinzufügen, möchten wir jegliches im Lösungsmittel ungebundene Aden ausspülen. Dazu leiten wir eine 1 %ige BSA-Lösung in PBS verdünnt durch. Da diese Chips für die nachgeschaltete genomische Analyse verwendet werden, sind alle verwendeten Lösungen RNA-frei.

Typischerweise spülen wir das Gerät mit vier bis fünf Volumina der 1%-BSA-Lösung. Anschließend geben wir unseren Antikörper hinzu. Der Antikörper für dieses Experiment ist CD 66 B sowie Antikörper, die spezifisch für Granulozyten im Vollblut sind.

Wir verwenden eine Konzentration von 10 bis 25 Mikrogramm pro Milliliter und injizieren den Antikörper. Wir injizieren 200 Mikroliter Antikörper in jedes Gerät. Dabei führen wir zwei Injektionen mit je hundert Mikrolitern durch, eine in jeden Anschluss des Geräts.

Üblicherweise injizieren wir hundert Mikroliter in einen Port und warten 30 Minuten, bevor wir weitere hundert Mikroliter in den gegenüberliegenden Port injizieren.