Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, translationsaktive Synaptoneurosomen aus der Maushirnrinde mithilfe eines diskontinuierlichen Percoll-Sucrose-Dichtegradienten herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Maushirnrinden gesammelt und homogenisiert werden und anschließend das Homogenat zentrifugiert wird. Danach wird das zentrifugierte Homogenat oder der Überstand auf vorgefertigte Percoll-Sucrose-Gradienten aufgetragen.

Der letzte Schritt besteht darin, die Synaptosomen-Fraktion zu zentrifugieren und zu sammeln. Schlussendlich zeigen Western-Blot-Analysen und S 35-Methionin-Inkorporationsversuche, dass die Synaptosomen-Fraktion synaptisch angereichert und translationsaktiv ist. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Zentrifugation und Filtration sind, dass erstens mechanische Schäden durch die Verwendung von Dichtegradienten vermieden werden und zweitens die Einzelzellen eine geringe Toxizität gegenüber den Zellen in ihren Bestandteilen aufweisen.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten mit diesem Protokoll, da die zeitliche Abfolge eine entscheidende Rolle spielt. Sobald die Kortices entnommen wurden, sollte das Verfahren zügig abgeschlossen werden. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die 3, 10, 15 und 23 %ige Gradientenschichten vorbereiten, indem Sie die entsprechenden Mengen an SIP gemäß der begleitenden Publikation zum GM-Puffer hinzufügen und gut vermischen.

Geben Sie die Gradientenschichten durch Pipettieren von jeweils zwei Millilitern aus den 23 15, 10 und 3 % isosmotischen Percoll-Lösungen in die Beckman-Zentrifugenröhrchen mit Verschluss. Mit einer P-1000-Pipette sollte die Grenzfläche zwischen den Schichten deutlich erkennbar sein, ohne dass es zu einer Durchmischung der Schichten kommt. Lagern Sie die Gradienten vor der Verwendung mindestens 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Bevor Sie dieses Verfahren beginnen, bereiten Sie die anderen erforderlichen Lösungen gemäß der begleitenden Publikation vor. Töten Sie die Maus im Alter von P13 bis P21 und bereiten Sie sie zur Sektion vor, indem Sie den Hinterkopf und den Nacken mit 70 %igem Ethanol besprühen. Schneiden Sie dann mit einer scharfen Schere durch das Rückenmark am Schädelansatz.

Entfernen Sie anschließend die Haut von der Schädeloberseite. Schneiden Sie den Schädel seitlich zwischen dem Parietalbein und dem Interparietalbein oder zwischen den Regionen des Großhirns und der Großhirnrinde. Danach schneiden Sie den Schädel entlang der Sagittalfuge von der Schädelbasis bis zur Nase.

Entfernen Sie in diesem Schritt vorsichtig den weichen Parietalknochen, indem Sie jedes Hemisphäre zur Seite ziehen. Danach führen Sie den Spatel über dem Kleinhirn in das Gehirn ein, um die Hirnrinde herauszulösen. Legen Sie diese in eiskalten GM-Puffer und wiederholen Sie den Vorgang erneut, um weitere Hirnrinden zu sammeln.

Spülen Sie die Kortizes nun in eiskaltem GM-Puffer. Überführen Sie anschließend zwei Kortizes in einen Glas-Down-Homogenisator, der fünf Milliliter kalten GM-Puffer enthält. Homogenisieren Sie die Kortizes vorsichtig mit fünf bis 10 Hubbewegungen des Stößels A, des losen Stößels, gefolgt von fünf bis 10 Hubbewegungen des Stößels B, des engen Stößels.

Die Anzahl der Hubstöße variiert je nach verwendetem Homogenisator. Überführen Sie das Homogenat in einen 15-Milliliter-Konustube. Zentrifugieren Sie es bei 1000 ×g.

Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Allegra-six-KR-Zentrifuge, um zelluläre Trümmer und Kerne zu pelletieren. Schichten Sie zwei Milliliter des Überstandes für jeden Percoll- oder Saccharosegradienten auf, wobei ein Gradient pro gesamter Kortex verwendet wird, und verschließen Sie die Röhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie sie in einem Festwinkelrotor bei 32.500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius in einer Beckman-J-2-21-Zentrifuge.

Wenn die geeigneten Adapter angebracht sind, sollte der Gradient ein starkes SN-Band aufweisen; pipettieren Sie die Lösung oberhalb des SN-Bandes ab und entsorgen Sie sie. Mit einer Glas-Pasta-Pipette wird das SN-Band an der 15- bis 23-%-Grenzfläche abpipettiert, wobei ein Gradient im Allgemeinen etwa 0,9 bis 1,1 Milliliter SNs ergibt. Danach wird es in ein kegelförmiges Reagenzglas überführt und auf Eis gelagert.

Danach die Salzkonzentration des SNS anpassen, indem ein Zehntelvolumen 10-fach konzentrierter Stimulationspuffer zugegeben wird. Optional Calciumchlorid 1000-fach zugeben, um eine Endkonzentration von 12 ano molar zu erreichen. Anschließend einen 1 mM TTX-Stammlösung zugeben, um eine Endkonzentration von 1 µM zu erreichen, um unspezifische Erregung zu unterdrücken.

Der nächste Schritt besteht darin, das SNS in der jeweiligen nachgeschalteten Anwendung einzusetzen, beispielsweise in Studien zur Proteinsynthese. Für andere Anwendungen kann das SN-Lysat mit dem Pierce-SDS-PAGE-Probevorbereitungskit gereinigt oder konzentriert werden. Die Proteinkonzentration des SNS kann mithilfe des Mikro-BCA-Protein-Assay-Kits bestimmt werden.

Hier ist ein Beispiel für sechs Bänder oder Fraktionen. Wenn die Maushirnrinde homogenisiert und auf diskontinuierlichen Percoll-Sucrose-Gradienten getrennt wurde, befanden sich die angereicherten SNS im Band fünf an der Grenzfläche von 23 zu 15 %; dieses Band wurde entnommen und mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Ein Beispiel intakter synaptischer Vesikel sowie die Erhaltung präsynaptischer und postsynaptischer Elemente ist hier im Western Blot dargestellt.

Ein Anstieg der synaptischen Marker und eine Abnahme der Verunreinigungen in der SN-Bande aus einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten zeigen, dass der Anstieg der S 35-Methionin-Inkorporation nach Zugabe von Glutamat auf eine de-novo-Proteinsynthese zurückzuführen ist. Es wurde 40 µM Anisomycin, ein Proteinsyntheseinhibitor, zugegeben. Diese Abbildung zeigt die deutliche Abnahme der S 35-Methionin-Inkorporation in Gegenwart von Anisomycin, unabhängig davon, ob Glutamat vorhanden ist oder nicht, verglichen mit den Grundniveaus.

Daher erzeugen diskontinuierliche Peral-Sucrose-Gradienten schnell hochaktive und relativ reine SNS, die zur Untersuchung der Proteinsynthese verwendet werden können. Diese Abbildung zeigt, dass Band fünf aus dem diskontinuierlichen Per-Core-Sucrose-Gradienten die höchsten Mengen an neu synthetisierten Proteinen aufweist. Die SNS, die durch Passage eines homogenisierten Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße und anschließender Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Per-Core-Sucrose-Gradienten hergestellt wurden, enthalten mehr gebrochene Membranen und weniger intakte SNS als die mit der diskontinuierlichen Peral-Sucrose-Gradienten-Methode gewonnenen SNS. Es wurde gezeigt, dass die mit der diskontinuierlichen Peral-Sucrose-Gradienten-Methode präparierten SNS eine höhere Aktivität der neu synthetisierten Proteine aufweisen als die mit der Filtrationsmethode hergestellten SNS.

Es wurde gezeigt, dass SNS, die aus jüngeren Mäusen gewonnen wurden, eine höhere translatatorische Aktivität aufweisen als solche aus älteren Mäusen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man translationsaktiv synaptische Neurozonen isoliert, indem man die Mauskortizes homogenisiert, das Homogenat in einem Schwenkköpfer zentrifugiert, das Überstandvolumen über ein Percoll-Sucrose-Gradient in einem Festwinkelrotor zentrifugiert und anschließend die resultierende Bande der synaptischen Neurozone sammelt.