Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine akute Gewebeschnittpräparation des Riechorgans oder des VNO der Maus herzustellen, um Calcium-Bildgebungsexperimente an Subpopulationen und/oder einzelnen Neuronen in lebendem Gewebe durchführen zu können. Dazu wird zunächst das VNO aus der Nase der Maus entnommen und anschließend unter einem Stereomikroskop in kalter aCSF aus seiner knorpeligen Kapsel mikrochirurgisch freigelegt. Danach wird das isolierte VNO senkrecht in einen Agarblock eingebracht, und akute koronare Gewebeschnitte werden mit einem Mikrotom geschnitten, um die Gewebeintegrität zu überprüfen.

Einige Schnitte werden nach der Immunhistochemie unter einem konfokalen Mikroskop untersucht. Andere Schnitte werden mit einem kalziumsensitiven Farbstoff beladen und anschließend mit vermuteten pheromonalen Liganden perfundiert, wobei die neuronale Aktivierung mittels Kalzium-Bildgebung beobachtet wird. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Geruchsfor­schungsbereich zu klären.

Beispielsweise werden Hunderte von Pheromonrezeptoren im Riechnasenorgan exprimiert, aber nur sehr wenige von ihnen haben identifizierte Liganden. Pheromonrezeptoren sind äußerst schwierig in einem heterologen System zu exprimieren. Wir mussten einen effizienten In-vivo-Assay entwickeln, um spezifische Pheromone bestimmten Rezeptoren zuzuordnen.

Wir können Tact-Mäuse verwenden, bei denen eine bestimmte Untergruppe von Neuronen unbekannte Rezeptoren exprimiert und anhand der Expression von GFP identifiziert werden kann. Wir könnten diesen Assay auch verwenden, um pharmakologisch Ionenkanäle und Enzyme zu untersuchen, die an der Fairmont-Signaltransduktionskaskade beteiligt sind, wie in der vorliegenden Prozedur gezeigt. Heute führen Julian und Fabian, zwei Forscher aus meinem Labor, den Versuch durch, bevor mit der Dissektion begonnen wird.

Bereiten Sie frische, kalte, mit Oxykarb gesättigte künstliche zerebrospinale Flüssigkeit (A CSF) zu, indem Sie alle Zutaten bis auf Calciumchlorid vermengen. Sättigen Sie die Lösung, indem Sie direkt Oxykarb durchperlen lassen. Fügen Sie danach das Calciumchlorid hinzu und stellen Sie mit doppelt destilliertem Wasser das gewünschte Volumen ein.

Halten Sie die A-CSF-Lösung bis zur Verwendung auf Eis. Nach der Euthanasie und Enthauptung einer erwachsenen Maus bereiten Sie eine Petrischale mit kaltem und kontinuierlich mit Sauerstoff und Kohlendioxid angereichertem A-CSF vor. Nach Entfernung des Unterkiefers wird der Kopf der Maus in die Petrischale gelegt.

Positionieren Sie den Mäusekopf unter dem Stereomikroskop, um das Gaumendach sichtbar zu machen. Führen Sie anschließend mit einer Mikroschere einen horizontalen Schnitt im oberen Teil des Gaumens durch und entfernen Sie die Gaumenmembran mit einer mikrochirurgischen Pinzette. Befeuchten und reinigen Sie die freigelegte Kavität mit ACSF.

Schneiden Sie den oberen und unteren Teil des Nasenseptums ab. Entnehmen Sie dann vorsichtig das Nasenseptum, das das VNO enthält, und geben Sie es direkt vertikal in saubere A-CSF. Trennen Sie die beiden Teile des VNO mit feinen Präparationspinzetten.

Identifizieren Sie die knorpelige Kapsel des VNO und entfernen Sie diese dann vorsichtig, wobei sichergestellt werden muss, dass alle knorpeligen Stücke entfernt werden. Das isolierte VNO, die knorpeligen Stücke und das nicht dissezierte VNO sind hier zuerst im Jahr angegeben, bereiten Sie 3 % Niedrigschmelz-Agar vor und richten Sie anschließend den Arbeitsplatz mit den notwendigen Werkzeugen ein. Füllen Sie die Einbettform mit Agar und stellen Sie sicher, dass die Temperatur unter 41 Grad Celsius liegt, bevor Sie das dissezierte VNO eintauchen. Positionieren Sie das Gewebe vertikal, um koronare Schnitte zu erhalten.

Stellen Sie die Einbettform eine Minute lang auf Eis, bis der Bohrer erstarrt. Nach einer Minute entfernen Sie den Bohrerblock, schneiden das Agar in eine parametale Form und kleben es anschließend mit dem Mikrotom an den Mikrotomschaft. Schneiden Sie koronare VNO-Schnitte am Mikrotom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Sekunde, einer Amplitude von 0,7 Millimetern und einer Dicke von 100 Mikrometern in kalter Zerebrospinalflüssigkeit (CSF).

Sammeln Sie die Gewebeschnitte mit einem Pinsel und geben Sie sie in eine Gewebekulturplatte, die mit kaltem A-CSF gefüllt ist, um die strukturelle Integrität der gesammelten Gewebeschnitte zu überprüfen. Anschließend können die Schnitte fixiert und für zytoskelettale Komponenten oder andere Proteine von Interesse immungefärbt werden. Hier demonstriert die Immunfärbung gegen acetyliertes Tubulin in Lila die strukturelle Integrität des Gewebeschnitts. Darüber hinaus zeigt die Beobachtung einer spezifischen neuronalen Population, in der ein bestimmter Pheromonrezeptor mit GFP markiert wurde, die erhaltene neuronale Morphologie: Neurone mit kleinen, ovalen Zellkörpern und langen Dendriten, die bis zur Oberfläche des Lumens reichen und mit Mikrovilli enden, können in einem abgedunkelten Raum beobachtet werden.

Die VNO-Schnitte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer Beladelösung aus kaltem A-CSF mit sieben Mikromolar URA 2:00 AM und 0,1 % Onic inkubieren. Die beladenen Schnitte bis zur Verwendung auf Eis unter Oxykarbonierung aufbewahren. Mithilfe eines Pinsels die beladenen Schnitte in eine Perfusionskammer mit A-CSF überführen und mit einem Gewebeschnittanker fixieren.

Platzieren Sie die Perfusionskammer auf dem Mikroskoptisch einer Calcium-Imaging-Anlage und perfundieren Sie kontinuierlich mit oxykarbonatisiertem aCSF bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die beladenen VNO-Schnitte mithilfe der Fluoreszenzwellenlängen, die dem Farbstoff entsprechen, also 340 bis 380 Nanometer für 4O2:00 AM. Nutzen Sie die geeignete Software, um intrazelluläre Calcium-Verhältnisänderungen aufzuzeichnen. Ein Perfusionsystem ist notwendig, um eine chemische Stimulation auszulösen.

Hier ist eine koronare Schnittansicht des VNO-Gewebes einer Maus, bei der die Subpopulation von Neuronen, die den Pheromonrezeptor V1Rb2 exprimieren, außerdem GFP exprimiert und gegen das acetylierte Tubulin-Protein (in Lila dargestellt) immunhistochemisch gefärbt wurde. Vergrößerte Aufnahmen des Schnitts zeigen die Erhaltung der Gewebeintegrität. Neurone mit langen Dendriten reichen bis zur Oberfläche des Lumens, und die Expression des Strukturproteins ist in den dendritischen Knöpfchen und Mikrovilli für die Kalzium-Bildgebung sichtbar.

Mit FU beladene Gewebeschnitte werden zunächst mithilfe von Hoffman-Phasenkontrast visualisiert, um das interessierende Feld ausgehend vom Blutgefäß, dem ersten weißen Pfeil, zu lokalisieren; der Beobachter bewegt sich langsam in Richtung des Lumens, des zweiten weißen Pfeils, und der neuroepithelialen Region. Der ovale Zellkörper des RO-Nasenneurons. Der dritte weiße Pfeil ist an seinem langen, dünnen Dendrit erkennbar.

Der vierte weiße Pfeil reicht in das Lumen, den neuronalen dendritischen Knopf. Der fünfte weiße Pfeil zeigt Mikrovilli, die mit Pheromonen beladenen Zellen berühren; hier gezeigt bei drei 80 Nanometern, anschließend nacheinander bei drei 40 und drei 80 Nanometern beleuchtet, und dieses Verhältnis der fluoreszierenden Wellenlängen wird als Graph dargestellt, der den intrazellulären Kalziumänderungen in den ausgewählten Neuronen entspricht, schwarze, rote und blaue Kreise. Ein TP wird verwendet, um die Lebensfähigkeit der Neuronen zu bestimmen.

Beachten Sie die Bandbreite der Kalziumantworten, die über die drei ausgewählten Neuronen hinweg zu beobachten ist, sowie die Tatsache, dass Neuron Nummer zwei (roter Kreis) nicht auf einen TP reagiert und daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen wird. Die chemische Stimulation wird anschließend unter Verwendung von Urin und einer Mischung aus Mauspheromonen in der Tiefe des Gewebeschnitts durchgeführt. Eine Teilpopulation von Neuronen, die sowohl GFP als auch den V1RRB2-Rezeptor exprimieren, kann lokalisiert werden.

Hier ist eine Neuron, das sowohl GFP als auch den V1RB2-Rezeptor exprimiert, zusammen mit einem Neuron, das V1RB2 nicht exprimiert, dargestellt. Beide Zellen sind mit URA 2:00 AM beladen, und das V1RB2-exprimierende Neuron zeigt einen Kalzium-Spitzenanstieg als Reaktion auf die Perfusion des Liganden des Rezeptors, 2-Heptanon. Interessanterweise reagiert auch das Neuron, das V1RB2 nicht exprimiert, auf 2-Heptanon, was die Komplexität der Pheromonverarbeitung im VNO verdeutlicht.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Maus präpariert und das mar-Zellorgan mikrodisziert, um die Vorbereitung akuter Gewebeschnitte durchzuführen. Dieses Protokoll kann auch für physiologische Untersuchungen unter Verwendung alternativer Kalziumfarbstoffe und Mikroskopaufbauten angepasst werden. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.