Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie man ein Laserschneidesystem für die Untersuchung der Axonregeneration in CL gans aufbaut und ausrichtet. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Laser, eine Linse, ein Thompson-Polarisator, eine λ/2-Platte, ein Umlenkspiegel, ein Periskop, eine Schiene und ein Riegelspiegel auf einer optischen Bank montiert werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, den Laserstrahl mit dem austretenden Strahl der Kondensorlinse des Mikroskops zu justieren.

Dann wird das Objektiv des Laserstrahlvergrößerers montiert, ausgerichtet und positioniert, um den Laserstrahl zu zentrieren und ihn streuungsfrei zu machen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Laserablationsfleck durch feine Justierungen mit dem Bildfokus deckungsgleich zu bringen. Letztendlich ist es möglich, mit dem beugungsbegrenzten Laserstrahl bei unvollkommener XY-NC-Ausrichtung Axone von einer halben Mikron Dicke präzise zu schneiden, wobei die Schädigung des umgebenden Gewebes minimal ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Femtosekunden-Lasern ist, dass sie mit 15.000 relativ kostengünstig ist. Sie ist relativ wartungsarm und ermöglicht ein sehr präzises Durchtrennen von Axonen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Regeneration von Axonen bei Seeigel-Larven ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise Fliegen, Zebrafische, Mäuse, das periphere Nervensystem und Zellen in vitro.

Grundsätzlich jede Zelle, die sich innerhalb von 30 bis 50 Mikrometern von der Oberfläche befindet. Beginnen Sie mit der Positionierung der Komponenten auf der Steckplatine und befestigen Sie den Laserperiskopträger sowie die erhöhten Schienenhalterungen mit Schrauben. Dieses System verwendet einen Laser der Klasse 3B, der Ihre Augen leicht beschädigen kann. Nehmen Sie daher den Laserschutz ernst.

Sprechen Sie mit jemandem in Ihrer örtlichen Physikabteilung darüber, wie man sicher mit freistrahlenden Lasern arbeitet. Stellen Sie während des gesamten Justiervorgangs die Laserleistung stets auf das Minimum ein. Wenn Sie durch die Okulare schauen, vergewissern Sie sich, dass der Laser mechanisch abgeschirmt ist und ausgeschaltet wurde.

Positionieren Sie nun zunächst das Mikroskop und richten Sie es mit der Schienenachse aus. Zweitens richten Sie es mit dem durchgehenden Lichtstrahl der Kondensorlinse des Mikroskops aus. Drittens richten Sie beide Enden der Schiene mit dem Kondensorstrahl aus, indem Sie eine verstellbare Blende oder Linse verwenden, die an der Schiene befestigt ist.

Verwenden Sie eine Wasserwaage und Laborkreuztische, um die Schienenhöhe einzustellen, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie sicher, dass beide Enden der Schiene ausgerichtet sind. Achten Sie nun darauf, dass der Laserstrahl durch die Drüse, den Thompson-Polarisator und die Halbwellenplatte hindurchtritt und nicht gegen deren Kanten rotiert.

Die Halbwellenplatte stellt die Laserleistung ein, nachdem alle Komponenten auf der Grundplatte befestigt wurden. Schalten Sie den Laser ein, stellen Sie die Pulsfrequenz auf 100 im Dauerstrichmodus ein und verringern Sie die Leistung mithilfe der Halbwellenplatte auf ein Minimum. Verwenden Sie einen Haftnotizzettel oder Linsenpapier, um den Laserstrahl sichtbar zu machen.

Jetzt wird der Laserstrahl von der Grundplatte nach oben geführt. Stellen Sie die kinematisch montierten Spiegel nacheinander vom Laser aus ein und befestigen Sie sie, um den Strahl bis zum Spiegel zu führen, der am Ende der erhöhten Führungsschiene montiert ist. Am Ende sollte der Laserstrahl ungefähr auf die Mitte der Spiegel ausgerichtet sein, und die Spiegel sollten vor der Justage des Laserstrahls mit dem durchgehenden Lichtstrahl des Mikroskops ungefähr in einem Winkel von 45 Grad zur Laserstrahlachse orientiert sein.

Entfernen oder öffnen Sie alle ND-Filter und Blenden im Zwischenmodul. Wir beginnen nun mit dem kritischsten Schritt, um eine präzise Durchtrennung der Axone ohne übermäßige Kollateralschäden zu erreichen. Wir werden den Laser exakt entlang der x-, y- und z-Achse bei der niedrigsten Laserleistung ausrichten, um den kleinstmöglichen Ablationspunkt zu erzeugen.

Der Laserstrahl und die durchgehenden Lichtstrahlen können gleichzeitig auf einem Blatt Papier sichtbar gemacht werden. Bringen Sie das Papier in die Nähe der Mikroskopöffnung, um zu beginnen. Richten Sie nun den Laser mit Hilfe der Grobverstellung des Spiegels auf dem Periskop und des Spiegels am Ende der Schiene aus.

Platzieren Sie ein Blatt Papier zwischen der justierten Kondensorlinse und dem offenen Objektivrevolver. Verwenden Sie weiterhin die Feineinstellungen am Spiegelträger, um den Laserstrahl in die Mitte des größeren durchgehenden Lichtstrahls zu justieren. Befestigen Sie nun das Mikroskop mit Klemmen an seiner Position.

Weitere Schritte zur Beurteilung der Justage des Lasers finden sich im schriftlichen Manuskript. Es müssen zwei Galilei-Strahlexpander installiert werden, um den 300-Mikrometer-Laserstrahl um den Faktor 33 zu erweitern, sodass er die hintere Öffnung des 10-Millimeter-Objektivs vollständig ausfüllt. Beginnen Sie damit, die vier Linsen auf ihre Fassungen zu montieren.

Befestigen Sie dann die Linsen an der Führungsschiene, sodass sich alle auf derselben optischen Achse befinden und exakt orthogonal zum Laserstrahl ausgerichtet sind. Schalten Sie den Laser ein und stellen Sie ihn auf minimale Leistung sowie auf Dauerbetrieb ein. Stellen Sie die Strahlausrichtung grob durch jede Linse hindurch ein.

Verwenden Sie Papier, um den Strahl zu sehen. Schalten Sie nun den Laser aus. Bringen Sie einen Sicherheitsverschluss am Laser an und entfernen Sie das Mikroskop aus der Bahn des Laserstrahls.

Schalten Sie den Laser wieder ein und visualisieren Sie ihn an einer nahe gelegenen Wand. Verwenden Sie die Feinjustierung der Linsen, um den Strahl zu erweitern. Passen Sie dann die letzten beiden kinematisch montierten Spiegel an, um den Strahl in einen Kreis mit gleichmäßiger Helligkeit an der geschätzten Position der rückwärtigen Objektivblende auszurichten.

Überprüfen Sie die Größe und Gleichförmigkeit des Strahls anhand eines Papiers. Stellen Sie dann den Strahl auf Nullkonvergenz ein, indem Sie beobachten, wie sich die Strahlgröße verändert, wenn das Papier weiter von der Linse entfernt wird. Schalten Sie den Laser aus und betätigen Sie den mechanischen Verschluss.

Schieben Sie das Mikroskop mithilfe der festen Klemmen wieder in den Laserstrahlengang, um die korrekte Ausrichtung zu definieren. Bringen Sie die Klemmen auf der freien Seite des Mikroskops erneut an, ziehen Sie sie jedoch noch nicht fest. Schalten Sie nun den Laser ein.

Entfernen Sie den Sicherheitsverschluss und drehen Sie das Objektivrevolver in eine offene Position, wobei Papier auf dem Objekttisch liegt. Ein erweiterter und gleichmäßiger Laserstrahl sollte sichtbar sein, der mittig zum durchgehenden Lichtstrahl des Kondensors ausgerichtet ist. Falls er nicht zentriert ist, zentrieren Sie die Strahlen, indem Sie die Mikroskopklemmen lösen und das Mikroskop vorsichtig justieren. Aktivieren Sie nun den Sicherheitsverschluss und schalten Sie den Laser in den Auslösemodus.

Bringen Sie das 60-fach-Objektiv in Position. Erstellen Sie nun ein Bild der Oberflächenkratzer auf einem Zielobjektträger. Entfernen Sie den Sicherheitsverschluss, lösen Sie den Ablationslaser aus und stellen Sie die Laserleistung auf den minimalen Ablationsfleck ein.

Der Fleck sollte kreisförmig sein und sich innerhalb von fünf bis 10 Mikrometern vom Bildzentrum, dem Ablationsfleck, befinden. Unter Verwendung der Feinverstellung des kinematisch montierten Spiegels am Schienenlauf, um den Fleck zentriert und das Strahlprofil gleichmäßig zu halten, ist es erforderlich, den am Schienenlauf montierten Spiegel und den oberen Periskopspiegel schrittweise anzupassen. Bewerten Sie den Z-Fokus des Lasers, indem Sie den Fokus systematisch in Ein-Mikrometer-Schritten nach oben und unten verschieben und den Ablationslaser in jedem Schritt auslösen.

Wenn der Strahl korrekt erweitert und ausgerichtet ist und die Konvergenz richtig eingestellt ist, sollte er maximal im Bildfokus ablatieren und schwach oder gar nicht, einen Mikrometer oberhalb oder unterhalb des Fokus. Wenn der maximale Ablationspunkt oberhalb oder unterhalb des Bildfokus liegt, nehmen Sie die endgültigen Einstellungen an der Z-Fokussierung des erweiterten Strahls vor, indem Sie die Linse L3 des galileischen Teleskops verschieben, bis die Laserablation mit dem Bildfokus übereinstimmt. Nematoden wurden auf eine maßgeschneiderte Objektträgerplatte montiert, und Axone wurden mit dem konstruierten System Laser-Exosomie ablatiert. Die Zeitrafferaufnahmen der Axonregeneration waren äußerst robust.

Mithilfe eines motorisierten Stages war es möglich, routinemäßig und präzise fünf Axone in fünf verschiedenen Tieren auf einem Objektträger zu schneiden und abzubilden. Die Bildaufnahmedauer für Axone stellte den limitierenden Faktor dar.

Etwa 10 % der Experimente ergaben Zeitrafferaufnahmen in hoher Qualität. Die übrigen Experimente lieferten alle gute Daten, waren jedoch ästhetisch weniger ansprechend aufgrund kleiner, ruckartiger Bewegungen des Wurms, die im Allgemeinen nach fünf bis acht Stunden Immobilisierung begannen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es stets wichtig, die Ausrichtung des Lasers entlang der x-, y- und z-Achse genau zu bewerten.

Das häufigste Problem bei dem Versuch, Axone zu schneiden, ist Kollateralschaden oder die vollständige Unfähigkeit, Axone zu durchtrennen, und dies liegt fast immer an einem falsch ausgerichteten Laser. Dieses Laserablationssystem und die Technik zur Visualisierung der Axonregeneration in C. elegans ermöglichen es Ihnen, routinemäßig den Effekt jeder genetischen Mutation auf die Axonregeneration zu untersuchen. NCL C. elegans.