Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Hallo, ich bin Tim Duso von Agriculture and AgriFood Canada. In diesem Video stellen wir ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Häufigkeit spezifischer Mikroorganismen in einer komplexen klinischen oder Umweltprobe mithilfe eines Bio-Plex-Instruments vor. Dieses Verfahren verwendet fluoreszierende Polystyrolkügelchen, die chemisch an eine artenspezifische Oligonukleotidsonde gekoppelt sind.

Ein Amplifikat wird aus der Probe mit universellen PCR-Primern erzeugt, und das Amplifikat wird an die mit Sonden gekoppelten Bärtchen hybridisiert. Mit dem Bio-Plex-Gerät werden zwei Signale erzeugt. Eines identifiziert das Bärtchen und eines quantifiziert das Hybridisierungssignal.

Das übergeordnete Ziel des Verfahrens besteht darin, ein Profil der gewünschten Mikrobiota auf schnelle und halbquantitative Weise zu ermitteln. Wir haben diese Technik angewandt, um bakterielle Profile in Vaginalabstrichen zu bestimmen, und die gewonnenen Daten zur Diagnose der bakteriellen Vaginose genutzt, einer klinischen Erkrankung, die durch eine Veränderung der Mikrobiota gekennzeichnet ist, bei der Lactobacillus-Organismen an Prävalenz verlieren und andere Organismen wie Gardnerella, Vais und Apoian Vae in Vaginalabstrichen nachweisbar werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Technik auch auf jede andere Mikrobiota angewandt werden kann, für die ein schneller Multiplex-Assay wünschenswert ist.

Beginnen wir mit der Beschreibung, wie das Verfahren funktioniert. Ein mikrobielles Profil wird erzeugt, indem ein Protein und das Chaperon-Gen in 60 von allen in einem DNA-Extrakt des Abstrichs vorhandenen Organismen amplifiziert werden. Einer der universellen Amplifikationsprimer ist durch die Hinzufügung von Biotin sowie durch die Einbindung von phosphatmodifizierten Basen modifiziert.

An ihrem 5′-Ende wird das Amplikon mittels T7-Exonuklease einsträngig gemacht, die ausschließlich den Antisinn-Strang abbaut. Da der Sinn-Strang durch einen phospha­thylierten PCR-Primer geschützt ist, werden oligonukleotidische Sonden, die komplementär zum verbleibenden Strang sind, kovalent an fluoreszierende Polystyrol-Perlen gekoppelt. Da jede einzigartige Perlenfarbe eine Sonde enthält, die einen anderen Organismus nachweist, können bis zu hundert verschiedene Perlen für eine einzelne Probe verwendet werden.

Das einzelsträngige PCR-Produkt aus dem Vaginalabstrich wird mit einer Sonden-gekoppelten Bead-Mischung hybridisiert, die Sonden für alle interessierenden Organismen enthält. Ein fluoreszenter Reporter, FICO Ethin, wird hinzugefügt, der über ein Strep-Din-Konjugat an die biotinylierten Sonden bindet. Schließlich wird die Hybridisierungsmischung an einem Luminex- oder Bio-Plex-Gerät analysiert, das jedes Bead einzeln hinsichtlich Identität und Hybridisierungssignal untersucht.

Die Ergebnisse dieser Analyse weisen auf das Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen hin, und die Intensität des Hybridisierungssignals korreliert mit der Häufigkeit des jeweiligen Organismus. Im Probe­material kann das Vorhandensein von mit bakterieller Vaginose (BV) assoziierter Organismen zur Diagnose von BV herangezogen werden. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu etablierten Verfahren wie der Gram-Färbung besteht darin, dass Informationen über das Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen sowie deren Häufigkeit gewonnen werden.

Den Vorgang wird Jennifer Town, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserem Labor, demonstrieren. Resuspendieren Sie die Mikrokügelchen durch Vortexen für etwa 20 Sekunden. Überführen Sie 400 Mikroliter der Mikrokügelchen in ein Eppendorf-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 14.000 × g für eine Minute. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Mikrokügelchen in 50 Mikrolitern 0,1 molarer MES-Pufferlösung (pH 4,5).

Fügen Sie ein Amino Capture-Oligo zu den Mikrokügelchen hinzu und mischen Sie durch Vortexen. Geben Sie 2,5 µL frische EDC-Lösung zu den Mikrokügelchen hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Entsorgen Sie die zuvor hergestellte EDC-Lösung und bereiten Sie eine frische Probe von 10 Milligramm pro Milliliter EDC in Wasser zu. Wie oben beschrieben, geben Sie weitere 2,5 Mikroliter der frischen EDC-Lösung zu den Mikrokügelchen hinzu und wirbeln fünf Sekunden lang. Inkubieren Sie erneut 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie ein Milliliter 0,02 % Tween 20 hinzufügen, kurz vortexen, um die Kügelchen zu resuspendieren, und dann eine Minute bei 14.000 × g zentrifugieren. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen erneut, indem Sie ein Milliliter 0,1 % SDS hinzufügen. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikroliter TE-Puffer.

Zählen Sie die Perlen in einem Hämocytometer, um die Stammlösungskonzentration zu bestimmen. Bereiten Sie eine Mikrokugel-Hauptmischung vor, indem Sie jede Perlenart in Puffer auf eine Endkonzentration von 100 Perlen pro Mikroliter verdünnen. Poolsen Sie die gekoppelten Perlen entsprechend der gewünschten Plexigkeit des Assays. Lagern Sie die Mikrokugel-Hauptmischung bei vier Grad im Dunkeln. Diese Mischung kann bei diesen Bedingungen monatelang gelagert werden. Erzeugen Sie das PCR-Produkt für jede Probe.

Fügen Sie das Phospholat- und Biotin-modifizierte Primer-Set an der 5'-Ende unmittelbar nach Abschluss der PCR hinzu. Geben Sie zwei Mikroliter T7-Exonuklease zu jedem PCR-Röhrchen hinzu und inkubieren Sie 40 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie am Ende dieser Inkubation 12,5 Mikroliter 0,5 M E-D-T-A, pH 8,0, hinzu und mischen Sie gut.

Dies ergibt insgesamt etwa 64,5 Mikroliter einsträngiges PCR-Produkt. Resuspendieren Sie den Mikrosphären-Mastermix vorsichtig mit einer Pipette. Geben Sie eine geeignete Menge in ein Eppendorf-Röhrchen ab.

Schließen Sie das Röhrchen und sonizieren Sie es zwei Minuten lang in einem Ultraschallbad. Geben Sie 17 µL Einzelstrang-PCR-Produkt in die entsprechenden Vertiefungen einer niedrigen 96-Vertiefungs-Platte und fügen Sie jeweils 33 µL der resuspendierten, sonifizierten Perlenmischung hinzu.

Decken Sie die Platte mit einer Silikonabdeckung ab und klopfen Sie leicht. Stellen Sie die Platte vorsichtig in den Thermocycler und führen Sie ein Programm aus: 95 Grad für fünf Minuten, 60 Grad für 10 Minuten, Halte- oder Pausenstufe bei 60 Grad für fünf Minuten. Beenden Sie das Programm und starten Sie es.

Stellen Sie eine frische Streptavidin-FICO-Ethin-Lösung her. Sie benötigen 25 Mikroliter pro Vertiefung. Bereiten Sie Streptavidin und FICO Ethin durch Verdünnung des Stamms mit je einem Milligramm pro Milliliter vor.

Eins in 50 bis 20 Mikrogramm pro Milliliter mit einem Mal TMAC-Puffer. Wenn der Thermocycler den Halteschritt bei 60 Grad erreicht, öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie die Silikonabdeckung und geben Sie die Strep-Din-FICO-Ethin-Lösung direkt in jedes Reaktionsgefäß. Setzen Sie die Silikonabdeckung wieder ein, schließen Sie den Deckel des Thermocyclers und setzen Sie das Programm fort.

Wenn das Programm abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte heraus und übertragen Sie sie umgehend auf die Bio-Plex-Maschine, um sie auszulesen. Die Platte sollte innerhalb von 10 Minuten gelesen werden. Lesen Sie die Platte bei 60 Grad aus.

Stellen Sie sicher, dass der Bio-Plex auf diese Temperatur vorgewärmt wurde. Dargestellt sind die Ergebnisse entsprechender Gram-Färbungen und Luminex-Profile von Längsschnittproben einer einzelnen Person zum Zeitpunkt null. Die Gram-Färbung ist vereinbar mit einer klinischen Diagnose von BV, was durch einen Fünffach-Luminex-Assay bestätigt wird, der positive Hybridisierungssignale für mit BV assoziierte Organismen zeigt, einschließlich Gardnerella, Atopobium und Aponiella.

Lactobacillus iners wird ebenfalls in geringen Mengen nachgewiesen, wobei die Konzentration im Zeitverlauf ansteigt. Bei dieser Person erfolgt ein Übergang von einer BV-assoziierten Mikrobiota zu einer normalen Mikrobiota, wie gramfärbende Untersuchungen zeigen. Die Luminex-Analyse derselben Proben zeigt, dass die Häufigkeit von Gardnerella vaginalis zunächst ein Maximum erreicht und anschließend abnimmt, während Lactobacillus iners zunimmt und zum dominanten Organismus zum letzten Zeitpunkt wird.

Mithilfe dieser Methode zur Profilierung der Mikrobiota werden Informationen über das Vorhandensein spezifischer Organismen sowie deren Häufigkeit gewonnen. Da die Methode auf Sequenzierung basiert, kann die Sondenentwicklung durch Tiefensequenzierungsanalysen gestützt werden, und Mikroorganismen, die mit Methoden der Next-Generation-Sequenzierung identifiziert wurden, können in Proben schnell und vergleichsweise kostengünstig verfolgt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein mikrobielles Profil aus einer Probe mithilfe eines Luminex- oder Bio-Plex-Instruments erstellt.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie man Oligonukleotid-Sonden an die fluoreszierenden Kügelchen koppelt, einsträngige Amplifikate aus einer klinischen oder Umweltprobe erzeugt, die Hybridisierung durchführt und die Ergebnisse an einem Luminex- oder Bio-Plex-Gerät bestimmt. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.