Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und effiziente Methode für die Festphasen-Peptidsynthese sowie die wässrige Selbstorganisation von Peptiden zu hochgeordneten Nanoblättern zu beschreiben. Strukturell ähnliche Polypeptiden sind Peptide substituierte Glycinpolymere, bei denen die Seitenketten am Stickstoffatom und nicht am Alpha-Kohlenstoffatom angebunden sind. Der Prozess beginnt mit der Synthese einer spezifischen Peptidsequenz über die Submonomer-Methode.

Die Submonomer-Methode umfasst zwei einfache chemische Schritte, bei denen jedes Monomer nacheinander in die Kette eingefügt wird. Zunächst wird ein an eine feste Phase gebundenes Amin bromoacetyliert. Danach wird das Bromid durch ein primäres Amin verdrängt.

Diese Schritte werden wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht ist. Nach der Kettenverlängerung wird das Peptid von der festen Trägersubstanz abgespalten, und das resultierende rohe Peptidöl wird mittels HPLC gereinigt und charakterisiert, um die Selbstorganisation der Peptide zu Nanoblättern einzuleiten. Eine verdünnte wässrige Pufferlösung des Peptids wird in einem Glasvial hergestellt und vorsichtig gemischt. Als letzter Schritt.

Die Nanoblätter werden unter dem Mikroskop untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass ein iterativer Zyklus aus zwei einfachen chemischen Schritten ein sequenzspezifisches Polymer ergeben kann, das spontan zu Nanoblättern selbstassembliert. Peptide stellen eine neuartige Klasse bioinspirierter Polymere dar, deren Eigenschaften zwischen denen von Proteinen und herkömmlichen Polymeren liegen.

Sie sind robust und synthetisch vielseitig einsetzbar wie herkömmliche Polymere, weisen aber zudem eine hohe Anpassbarkeit und Sequenzspezifität auf. Peptide erweisen sich daher als fortschrittliches Material zur Lösung zentraler Probleme in der Biomedizin und Materialwissenschaft, beispielsweise bei der Identifizierung bioaktiver Wirkstoffe oder der Entwicklung künstlicher Proteine. Zu den wesentlichen Vorteilen von Peptiden zählen die exakte Kontrolle der Sequenz, die Verfügbarkeit äußerst vielfältiger Bausteine, eine effiziente Synthese sowie die Stabilität gegenüber Proteasen. Die allgemeine manuelle Synthese-Methode für Peptide, die auf einfachen Geräten und handelsüblichen Reagenzien basiert, wird beschrieben und ermöglicht die einfache Herstellung von Peptiden in den meisten Laboratorien.

Die visuelle Demonstration der Syntheseschritte ist entscheidend und dient als wertvolle Referenz für Personen, die in den Bereich der Festphasensynthese einsteigen. Hier wird erstmals die Reinigung und Charakterisierung eines amphiphilen Peptids mit 36 Aminosäuren beschrieben sowie dessen Selbstorganisation zu hochgeordneten Nanoblättern. Beginnen Sie dieses Protokoll mit dem Aufbau der Versuchsapparatur, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Die folgenden Schritte werden aus Gründen der Übersichtlichkeit in einem Glasreaktionsgefäß anstelle einer Einweg-Polypropylen-Fritte durchgeführt. Nach der Einrichtung von 100 Milligramm R-Amid-Harz in einem gefritteten Reaktionsgefäß wird das Harz durch Zugabe von zwei Millilitern Dimethylformamid oder DMF geschwollen; die Mischung wird 10 Minuten lang durch Spülen mit Gas bewegt. Anschließend wird die Lösung unter Vakuum abgesaugt, um das aufgequollene Harz zu isolieren.

Fügen Sie anschließend ein Milliliter 20%ige vollständige Methylpyridin in DMF hinzu, um die FMOC-Gruppe zu deprotektieren. Schütteln Sie zwei Minuten lang und lassen Sie die Flüssigkeit ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwölf Minuten lang, spülen Sie dann das Harz durch Zugabe von zwei Milliliter DMF, Schütteln für 15 Sekunden und anschließendes Ablassen.

Beginnen Sie mit dem Wachstum der Peptidkette durch den ersten Submonomeren-Zyklus, der eine Bromoacetylierung und einen Substitutionsschritt umfasst. Für die Bromoacetylierung geben Sie ein Milliliter 0,6-molare Bromessigsäure in DMF und 86 Mikroliter Diisopropylcarbodiimid hinzu. Nach 30-minütigem Rühren abtrennen und mit zwei Milliliter DMF spülen.

Führen Sie anschließend die Abspaltung durch, indem Sie ein Milliliter einer ein- bis zweimolaren Aminlösung in endständigem Methylpyrogenon zugeben und 30 bis 120 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation ablassen und mit zwei Milliliter DMF spülen. Setzen Sie anschließend das Wachstum der Peptidkette fort, indem Sie den Submonomeren-Zyklus wiederholen. Nach Abschluss der endgültigen Abspaltung mit zwei Milliliter DMF spülen.

Daraufhin eine Diora-Methan-Waschkappe anbringen und das Reaktionsgefäß bis zur Spaltung aufbewahren. Um die Spaltung zu beginnen, das gesamte getrocknete Harz in ein 20-Milliliter-Scintillationsglas umsetzen, wobei im Abzug und unter Verwendung der richtigen persönlichen Schutzausrüstung gearbeitet wird. Vier Milliliter Trifluoressigsäure oder TFA-Spaltcocktail zum Scintillationsglas hinzufügen und verschließen. Zehn Minuten bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gründlich umrühren.

Alternativ kann ein Rüttelapparat verwendet werden, um die Lösung zu mischen. Sammeln Sie die TFA-Spaltungslösung, indem Sie das Harz durch eine Einweg-Polypropylen-Glasfritte in ein neues vorher gewogenes 20-Milliliter-Scintillationsglasfläschchen filtrieren. Geben Sie anschließend ein Milliliter frisches Spaltungscocktail hinzu, um das Harz zu spülen und eventuell verbliebene Peptidreste zu gewinnen.

Wiederholen Sie dies und spülen Sie zweimal aus. Verdampfen Sie die TFA, indem Sie einen sanften Strom von Stickstoff einleiten, oder verwenden Sie einen Biot-Charger. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem V 10-Verdampfer und lösen Sie das Rohöl in sechs Millilitern einer 1:1-Acetonitril-Wasser-Mischung.

Dann frieren und lyophilisieren Sie die Probe. Dieser Vorgang sollte einmal mehr nach der zweiten Lyophilisierung wiederholt werden. Notieren Sie das Gewicht des Rohprodukts und lagern Sie es als trockenes Pulver bei minus 20 Grad Celsius auf, unter Verwendung einer Kombination aus schimmelpilzanalytischer HPLC und/oder Elektrospray-LCMS.

Die Reinheit des Rohprodukts und das Vorhandensein des gewünschten Molekulargewichts können anhand der im Text beschriebenen Verfahren überprüft werden. Die Peptidmischung im Rohprodukt kann anschließend gemäß dem schriftlichen Verfahren mittels umgekehrter Phase präparativer HPLC gereinigt werden. Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll zur Herstellung von Schichten aus einer einzelnen kettenförmigen, sequenzspezifischen amphiphilen 36-me-Peptidsequenz.

Nachdem die Peptidkette synthetisiert, gereinigt und lyophilisiert wurde, wird das resultierende weiße Pulver in DMSO gelöst, um eine zwei Millimolar starke Stammlösung herzustellen. Als Nächstes besorgen Sie eine Dr.Glass-Datei, um eine 20-Mikromolar-Peptidlösung vorzubereiten. Geben Sie zunächst 445 Mikroliter Milli-Q-Wasser und 50 Mikroliter 10×-Fibrillenbildungs-Puffer hinzu.

Vortexen Sie das Gefäß, um es zu mischen. Geben Sie anschließend fünf µL einer zwei Millimolar Peptid-Stammlösung hinzu und lassen Sie es sanft quellen. Die resultierenden Lösungsblätter entstehen durch sanftes Schütteln der verdünnten wässrigen Peptidlösung.

Langsames Kippen des verschlossenen Glasröhrchens von der horizontalen in die aufrechte Position. Führt zu sanftem Schütteln in Schichten und ergibt ebenfalls Schichten. Die Schichten neigen jedoch dazu, kleiner zu sein und weniger gerade Kanten aufzuweisen als viele hochwertige Schichten.

Drehen Sie die Glasgefäße langsam über die horizontale Achse für einen Tag mithilfe eines Röhrenrotators oder eines angepassten Schüttlers, um nano-skalige Schichten fluoreszent zu färben. Geben Sie einen Mikroliter einer 100-Mikromolar-Nile-red-Lösung zu 100 Mikrolitern der nano-skaligen Schichten-Lösung, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar Nile red zu erhalten. Nile red ist ein umweltsensitiver Farbstoff, dessen Fluoreszenzintensität zunimmt, wenn er sich in hydrophoben Umgebungen anreichert. Danach stellen Sie eine 1 %ige Aros-Lösung in heißem Wasser her und gießen sie in eine Kunststoff-Petrischale.

Stellen Sie sicher, dass die Aros-Lösung etwa ein Achtel Zoll dick ist, und lassen Sie die Lösung ungestört auf einer flachen Oberfläche abkühlen. Nachdem sich das Aros gesetzt hat, schneiden Sie mit einem Spatel Quadrate von einem Zentimeter mal einem Zentimeter. Überführen Sie die geschnittenen Quadrate dann auf einen Objektträger, um die Schichten in derselben Ebene zu sammeln, und geben Sie einen Mikroliter Schichtlösung auf das Stück Aros.

Nach zwei Minuten sollten die Aros das Pufferlösung aufgenommen haben, wodurch die Blätter an der Oberfläche verbleiben. Bildgebungsanalyse des Blattes innerhalb von 15 Minuten durchführen. Alternativ, um Blätter und Lösung abzubilden, 15 Mikroliter in eine 20 Millimeter Durchmesser große, 0,12 Millimeter dicke Dichtung auf einem Objektträger geben.

Bedecken Sie die Probe mit einem Deckglas und nehmen Sie die Aufnahme innerhalb weniger Tage vor, um die REM-Analyse der Nanoblätter durchzuführen. Ätzen Sie zunächst Siliziumchips im Plasma, um die Absorption der Nanoblätter zu fördern. Geben Sie dann 20 Mikroliter der Peptid-Blattlösung auf ein im Plasma behandeltes Siliziumsubstrat und lassen Sie die Lösung drei Minuten lang stehen. Entfernen Sie überschüssige Lösung mit der Spitze eines Kim-Tuchs. Geben Sie 20 Mikroliter Wasser auf die Oberfläche und saugen Sie erneut die überschüssige Flüssigkeit ab, um Puffer und Salze zu entfernen.

Alternativ werden die Peptid-Blatt-Lösungen gegen Wasser dialysiert, um Puffer und Salz zu entfernen. In diesem Fall können 20 Mikroliter der dialysierten Blattlösung auf die plasmabehandelten Siliziumsubstrate gegeben und an der Luft trocknen gelassen werden. Nachdem die Blattlösung auf den plasmabehandelten Siliziumsubstraten getrocknet ist, kann das Blatt mit REM unter Verwendung eines In-Lens-Detektors bei Strahlenergien zwischen ein Kilovolt und fünf Kilovolt abgebildet werden.

Die Synthese, Charakterisierung und Reinigung eines sequenzspezifischen 36 me-Blockladungs-Peptids, das sich zu einem hochgeordneten zweidimensionalen Nanoblatt falten kann, wurde durchgeführt. Die Amine aus der Synthese des 36 me-Blockladungs-Peptids werden Boc-Ethylendiamin mit Phenethylamin und t-Butyl-β-Alanin verknüpfen. Nach der Synthese wurde das rohe Peptid mit 95%iger wässriger TFA von der Harzmatrix abgespalten.

Nachdem die TFA-Lösung gesammelt und eingedampft wurde, wurde das rohe 36-me-Blockladungs-Peptid mittels umgekehrter Phase-HPLC gereinigt. Die Masse des gereinigten Blockladungs-Peptids wurde anschließend durch moldy bestätigt.

Die beobachtete Masse von 4981,2 stimmt gut mit der berechneten Masse von 4981,74 überein. Das lyophilisierte Pulver wurde in DMSO gelöst, um eine zwei Millimolare Stammlösung herzustellen, und bei vier Grad Celsius gelagert. Die Blätter wurden gemäß dem zuvor genannten Protokoll hergestellt und mit fluoreszenzoptischer Mikroskopie abgebildet.

Es werden verschiedene Formen mit Strukturgrößen von bis zu 300 Mikrometern beobachtet, wobei insbesondere gerade Kanten deutlich hervortreten. Mit Hilfe der REM wurde ebenfalls die Abbildung der Blättchen durchgeführt, die ebenfalls ausgeprägte gerade Kanten zeigt. Dieses Video beschreibt ein einfaches und effizientes Protokoll für die Festphasensynthese von Peptiden und die wässrige Selbstorganisation von Peptiden zu Nanoblättchen.

Da buchstäblich Hunderte von Aminosäure-Bausteinen leicht verfügbar sind und in diesem Protokoll verwendet werden können, ist der mit Polypeptiden zugängliche Gestaltungsspielraum praktisch unbegrenzt. Peptide sind aufgrund ihrer synthetischen Flexibilität, Robustheit und Ordnung vielversprechende Materialien für die biomedizinische und nanowissenschaftliche Forschung. Insbesondere auf atomarer Ebene eignen sich die Nanoblätter als potenzielle Plattform für zweidimensionale Display-Scaffolds, Membran-Mimetika, biologische Sensoren, Protein-Mimetika und die Herstellung von Bauelementen.

Das Arbeiten mit ätzenden Reagenzien wie Trior, Essigsäure und Bromessigsäure ist äußerst gefährlich. Um Verletzungen zu vermeiden, führen Sie alle Reaktionen in einem Abzug durch und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.