Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die durch die Lufträume in Pflanzenblättern verursachte Beeinträchtigung biologischer Bilder zu minimieren, um klarere Aufnahmen lebender Zellen innerhalb des Blattes zu erhalten. Wenn das Blatt in einem wässrigen Montagemedium eingebettet ist und ein Fluorophor durch einen Laser angeregt wird, beschränken viele nicht gefüllte Lufträume und Brechungsindexänderungen innerhalb des Gewebes, die in orange dargestellt sind, die Signalstärke aus tieferen Gewebeschichten im resultierenden Bild. Wird das Blatt hingegen in Perfluor-Dekalin (PFD) eingebettet, wird die resultierende Laseranregung des Fluorophors weniger abgeschwächt und ermöglicht eine bessere Übertragung der emittierten Signale.

Letztlich ermöglicht die Verwendung der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie mit dem PFD-Montagemedium klare Bilder lebender Zellen innerhalb des Pflanzenblattes in einer Tiefe, die mehr als doppelt so groß ist wie bei Verwendung eines wässrigen Montagemediums. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fixierung oder der Montage von Blättern mit wässrigen Medien besteht darin, dass sie die Brechung im Mesophyll verringert und eine genauere Abbildung lebender Zellen in tieferen Blattschichten ermöglicht, was bisher problematisch war. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Pflanzenwissenschaft zu beantworten, wie zum Beispiel die Erforschung des Mesophylls, der Zellbiologie und der Signalübertragung in vivo, die Besiedlung von Blättern durch Pathogene sowie die Interaktionen zwischen Pathogenen und dem Mesophyll, obwohl diese Methode auch Einblicke in grundlegende pflanzliche Biologie ermöglicht.

Es kann auch auf andere stark lichtbrechende Gewebe angewendet werden, die reich an Lufträumen sind, wie zum Beispiel Spiralen im Inneren oder der Wirbeltierlunge. Den Ablauf dieses Verfahrens wird Dr. George Littlejohn aus meinem Labor, To Mount Leaf, demonstrieren. Die Probenvorbereitung in PFD beginnt mit der Herstellung eines Objektträgers mit einer gasdurchlässigen Dichtung aus Polydimethylsiloxan oder P-D-M-S. P-D-M-S ist ein viskoelastisches Polymer, das formbar ist, um eine Kammer zu schaffen, die an die experimentellen Anforderungen angepasst werden kann.

Äquilibrieren Sie das PFD mit Luft, indem Sie eine kleine Menge PFD in einer luftgefüllten Flasche schütteln. Dies kann auch erreicht werden, indem man anschließend Luft durch das PFD bläst, das PFD in eine offene Petrischale dekantiert und einen ganzen Keimling oder ein ausgeschnittenes Blatt fünf Minuten lang auf die Flüssigkeit aufschwimmen lässt. Das Gewebe sollte durchscheinend werden, ähnlich wie vitrifiziertes Gewebe.

Die Blätter können je nach Beleuchtungsbedingungen und Alter des verwendeten Gewebes dunkler oder heller erscheinen als vor der Exposition gegenüber PFD. Füllen Sie die PDMS-Kammer abschließend mit aero-äquilibriertem PFD und übertragen Sie die Gewebeproben vorsichtig aus der Inkubations-Petri-Schale in die PDMS-Kammer. Verschließen Sie die Probe mit einer Deckglasabdeckung und nehmen Sie die Bilder auf.

Je nach experimentellen Anforderungen wurden Monate lang belassene Blätter fünf Minuten lang in einer Suspension aus rekombinantem grün fluoreszierendem Protein oder GFP inkubiert. Bei der PFD-mikroskopischen Untersuchung von PFD-inkubierten Blattproben zeigt sich, dass der Großteil der Lufträume mit rekombinantem GFP, das in PFD suspendiert ist, überflutet wurde. Das GFP erscheint in Grün, und das Rot stellt Chlorophyll, Lotto-Fluoreszenz und Delits-Meso-Füllzellen dar.

Es ist ersichtlich, dass das Blatt nach der Inkubation mit PFD geflutet ist, jedoch gelegentlich Lufttaschen verbleiben können. Unter diesen Bedingungen flutet Wasser das Blatt nicht. Hier werden opsys-Blätter, die Venus, eine Variante von YFP, exprimieren, welches im Cytosol lokalisiert, in Luft, Wasser oder PFD inkubiert und zur Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie montiert. Die konfokale Mikroskopie der Proben zeigt einen Vorteil von PFD gegenüber Luft und Wasser mit einer ungefähr zweifachen Zunahme der Abbildungstiefe.

Beim Vergleich von PFD und Wasser: Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei richtiger Durchführung in fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass perfluores Zellulose Nagellack und Teflon auflöst, aber mit Silikonfett verträglich ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Perfluordelin als Einbettungsmittel verwendet, um die Bildgebung in Zellen von Pflanzenblättern zu verbessern.

Vergessen Sie nicht, dass, obwohl Perfluorodelin ungiftig ist, die Einhaltung der üblichen Sicherheitsmaßnahmen empfohlen wird, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.