RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, postembryonale Regulatoren der Proteinexpression und -lokalisation in C. elegans mittels eines auf RNAi basierenden genomischen Screenings und fluoreszenzmarkierter Proteine zu identifizieren. Sobald der geeignete Screening-Stamm konstruiert ist, wird eine RNAi-Bibliothek ausgewählt. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bibliotheksklone in Bakterien zu verpacken.

Anschließend werden die Bakterien ausgewählt, angezüchtet und staged C. elegans-Nematoden verfüttert. Nach einer Wachstumsphase von 72 Stunden werden die Nematoden auf Veränderungen im Phänotyp der Untersuchung untersucht. Letztendlich werden Veränderungen in der Expression oder subzellulären Lokalisation des betroffenen Proteins mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Diese Methode kann Gene identifizieren, die für die korrekte subzelluläre Lokalisation eines fluoreszenzmarkierten Proteins erforderlich sind. Allerdings kann dieses Protokoll modifiziert werden, um Gene zu identifizieren, die andere postembryonale Phänotypen von Interesse beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden publizierten Protokollen liegt darin, dass wir die Konsistenz und Intensität der RNAi-Antwort bei den Tieren optimiert haben, indem wir die Produktion der doppelsträngigen RNA in Bakterien vor dem Aufplattieren induziert haben.

Die Durchführung des Verfahrens wird Kathy Fuss, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren. Innerhalb von zwei Monaten nach Beginn des Experiments bereiten Sie die Klonbibliothek vor, indem Sie Bakterien von ausgewählten Klone der Fütterungsbibliothek sowie von positiven und negativen Kontrollen auf LB-Platten mit Tetracyclin anstreichen. Verwenden Sie als positive Kontrolle einen Klon, der ein Gen enthält, das einen dosisabhängigen postembryonalen Phänotyp hervorruft, beispielsweise BLE vier. Verwenden Sie als negative Kontrolle einen leeren Vektor oder einen Klon, der ein vorhergesagtes Pseudogen ohne beobachtbare Phänotypen enthält.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht, und impfen Sie für jeden Klon zwei Milliliter LB-Medium, das 50 Mikrogramm pro Milliliter Carbonat enthält, mit einer einzelnen Kolonie aus den Strichplatten an. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht unter Schütteln. Am nächsten Morgen sollten die Lösungen trüb sein; induzieren Sie die Produktion von doppelsträngiger RNA durch Zugabe von IPTG zu den Kulturen, und inkubieren Sie sie weitere vier bis fünf Stunden unter denselben Bedingungen.

Das Hinzufügen von IPTG gewährleistet eine konsistentere und stärkere, durch RNAi induzierte Herunterregulation des Genprodukts, als wenn man sich allein auf das IPTG und den Bohrer des NGM-Plättchens verlässt. Nach der IPTG-Inkubation werden 30 Mikroliter Kultur von jedem Klon in jedes Loch der vorbereiteten 24-Loch-NGM-RNAi-Platten aufgetragen. Ein Klon pro Loch. Jede Platte sollte zwei Löcher für die Kontrollen vorgesehen haben.

Markieren Sie sorgfältig den Ort jeder Bibliothek. Klonen Sie in die 24-Well-Platten und stellen Sie die Platten anschließend ungefedert in eine sterile Flusshaube, um sie etwa 20 Minuten lang trocknen zu lassen. Lassen Sie nicht zu, dass sich die Ränder des Agars von der Platte lösen.

Nachdem die fadenwürmer in definierten Entwicklungsstadien auf die Platten getrocknet wurden, folgen Anweisungen zur Vorbereitung der Fadenwürmer. Im nächsten Abschnitt beginnen Sie mit einer synchronisierten Population von Larven des ersten Stadiums oder L1-Fadenwürmern. Der Start mit L1-Larven umgeht potenzielle embryonale Letalphänotypen.

Wenn eine tierische Population in verschiedenen Entwicklungsstadien zur Untersuchung vorliegt, erhöht dies das Vertrauen dabei, dass beobachtete Variationen auf der RNAi beruhen und nicht einfach auf normalen Schwankungen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien beruhen. Falls die RNAi jedoch eine Entwicklungsverzögerung verursacht, sollte dies vom Untersucher beim Bleichen bemerkt werden. Eine Population gemischter Stadien des untersuchten Stammes.

Nur Embryonen mit intakter Eischale überleben diesen Schritt; die Entwicklung der Tiere erreicht dann ein Stadium innerhalb von 12 Stunden bei 20 Grad Celsius oder innerhalb von 18 Stunden, wenn der Schritt am Tag der Inokulation der Bakterienkulturen bei 16 Grad Celsius durchgeführt wird. Wählen Sie drei 100 Millimeter Petrischalen mit gesunden Tieren des Screening-Stamms aus, die sowohl gravitierende Larven als auch erwachsene Tiere und Embryonen enthalten.

Spülen Sie alle Tiere in sterilen M-neun-Medien und überführen Sie die Abwässerung in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen mit Schraubverschluss. Wenn die Abwässerung mehr als 3,5 Milliliter beträgt, zentrifugieren Sie die Tiere und entfernen Sie die Flüssigkeit bis auf 3,5 Milliliter. Wenn weniger als 3,5 Milliliter.

Erhöhen Sie das Volumen mit Wasser oder M nine auf 3,5 Milliliter, um die Embryonen von den adulten Tieren zu lösen, jeweils mit 1,5 Milliliter einer Mischung aus Natriumhydroxid und Bleichmittel pro Waschdurchgang. Lassen Sie die Tiere nicht länger als 10 Minuten in dieser Lösung inkubieren. Starten Sie nach dem Einschalten eines Zeitgebers jedes Gefäß 10 Sekunden lang im Vortex-Mischer und wiederholen Sie das Vortexen alle zwei Minuten.

Nach jedem Wirbeln beobachten Sie die Lösung unter einem Stereomikroskop auf Tierkadaver. Innerhalb von sechs bis acht Minuten werden sich die erwachsenen Exemplare zersetzen und die Embryonen sollten freigesetzt werden. Entfernen Sie die Embryonen aus der Bleichlösung, indem Sie sie pelletieren und so viel wie möglich vom Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören.

Resuspendieren Sie das Pellet anschließend in einem Volumen von 10 Milliliter, indem Sie steriles M neun hinzufügen und schütteln. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang mindestens einmal erneut, bis der Geruch von Bleichmittel vollständig nicht mehr wahrnehmbar ist. Um die Tiere exakter in ihrem L ein-Stadium zu synchronisieren, lassen Sie die Embryonen in M neun-Medium ohne Nahrung schlüpfen.

Dies erfolgt, indem die Embryonen in M9 in einen kleinen Erlenmeyerkolben überführt werden. Schütteln Sie den Kolben über Nacht bei der für den Stamm und das Experiment geeigneten Temperatur. In dieser Zeit schlüpfen alle Tiere und verharren am nächsten Tag im L1-Diapause.

Setzen Sie das Larvenwachstum von einem bestimmten Zeitpunkt an fort, indem Sie die Tiere auf die vorbereiteten Bakterien übertragen, die doppelsträngige RNA exprimieren. Dies erfolgt am selben Tag, an dem die 24-Loch-Platten mit Bakterien beimpft wurden. Übertragen Sie zunächst die L1-Tiere in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie. Konzentrieren Sie die Tiere dann in 0,5 bis 1 Milliliter M9 und geben Sie fünf Mikroliter der konzentrierten Nematoden auf eine Platte.

Zählen Sie die Anzahl der Tiere auf der Platte und passen Sie die konzentrierte Nematodenlösung entsprechend an. TE 30 Würmer für jeweils drei bis 10 Mikroliter. Geben Sie abschließend etwa 30 µL einstufige Tiere in jede Vertiefung der vorbereiteten Platte mit Bakterien auf.

Bei einer 24-Well-Platte kann eine Anzahl von mehr als 30 Tieren pro Mulde zu Verhungern führen. Nachdem die Tropfen getrocknet sind, was einige Minuten dauert, befestigen Sie den Deckel mit dem Gummiband und inkubieren Sie die Tiere invertiert bei der erforderlichen Temperatur und Dauer, um die Tiere im gewünschten Entwicklungsstadium zu analysieren. Sobald die Nematoden zur Untersuchung bereitstehen, überprüfen Sie, ob die positiven und negativen Kontrollen die erwarteten Phänotypen zeigen. Anschließend beobachten Sie die experimentellen Tiere auf Entwicklungsauffälligkeiten.

Als Nächstes montieren Sie unter Verwendung eines Stereomikroskops acht bis zwölf Tiere aus jedem Well auf 4 % Agar-PET-Objektträger mit einem Tropfen Anästhetikum von fünf Mikroliter. Nachdem das geeignete Deckglas aufgebracht wurde, führen Sie Beobachtungen an mindestens fünf Tieren mittels Lichtmikroskopie durch. Führen Sie eine geordnete Datenbank mit dem Gen, der Anzahl beobachteter Tiere und den phänotypischen Ergebnissen.

Überprüfen Sie für jedes RNAi-Experiment jedes durch RNAi hervorgerufene Phänotypen nach Möglichkeit anhand eines weiteren sekundären Phänotyps und durch Wiederholung des Experiments; bei wiederholten Experimenten können Bakterien derselben Aufstrichkultur verwendet werden. Ältere Aufstriche können ein schlechtes Wachstum in flüssigen Übernachtkulturen verursachen und sollten zuerst neu aufgestrichen werden. Einige Bakterienkulturen wachsen möglicherweise aufgrund des in ihrem Plasmid exprimierten Genprodukts nicht gut.

Konzentrieren Sie in diesem Fall die Bakterien einfach vor dem Ausplattieren. Für eine laufende Untersuchung ist es wichtig, stets ausreichend Embryonen zur Verfügung zu haben, die für die Stadieneinteilung bereitstehen. Der Untersuchungsstamm sollte stets gefüttert und niemals gehungert werden und frei von Kontaminationen sein, die das Phänotypinteresse beeinflussen könnten.

Wir haben einen Wartungsplan für die Fütterung der Tiere erstellt. Gene, die die Lokalisation von DBL-1 beeinflussen, wurden mittels RNAi unter Verwendung eines speziell für diesen Screen konzipierten Stammes identifiziert. Die normale Expression des GFP-Markers dbl-1 umfasst Zellkörper der ventralen Nervenstrang und eine Reihe von Pünktchen bei Tieren, die Antisense-RNA gegen DBL verabreicht bekamen.

Eine mRNA wies eine stark abgeschwächte Expression von DBL eins auf. Diese Tiere waren ebenfalls klein, ähnlich wie Tiere, denen funktionelles DBL L eins fehlte. Der RNA-I-Screen identifizierte erfolgreich viele weitere Gene, deren Produkte die Lokalisation von DBL eins beeinflussen, wodurch unser Verständnis darüber erweitert wurde, wie TGF-Beta zellulär transportiert wird, und gleichzeitig einen Ausgangspunkt für zahlreiche weitere Untersuchungen bot.

Mithilfe dieser Methode kann eine einzelne Person vernünftigerweise zwei bis vier Experimentreihen pro Woche durchführen und beobachten. Beispielsweise können am Montag und Dienstag präparierte Tiere jeweils am Donnerstag und Freitag beobachtet werden, und Tiere können erneut am Freitag und Samstag für Montag und Dienstag präpariert werden. Beobachtung, während Sie dieses Verfahren während Ihres Screenings befolgen.

Es ist wichtig, stets eine ausreichende Anzahl von Embryonen zur Bestimmung des Entwicklungsstadiums bereitzuhalten, daher sollte der Untersuchungsstamm regelmäßig gepflegt werden. Außerdem ist es wichtig, detaillierte Notizen zu allen Beobachtungen anzufertigen.