Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

Dieses Experiment zielt auf eine direkte Messung der Acetat-bildenden Aktivität der Acetatkinase ab. Starten Sie die Reaktion durch Zugabe des Enzyms zu einer Reaktionsmischung, die Acetylphosphat und einen DP-Substrat enthält. Anschließend geben Sie Hydroxylaminhydrochlorid hinzu, um das verbleibende Acetylphosphat in Acetylhydroxylat umzuwandeln.

Geben Sie Entwicklerlösung hinzu, um das Acetylhydroxylat in einen farbigen ferrischen Hydroxylat-Komplex umzuwandeln, der gemessen werden kann. Die spektralphotometrische Bestimmung basierend auf der Menge an verbrauchtem Acetylphosphat-Substrat ermöglicht die Ermittlung enzymkinetischer Parameter. Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie auf der direkten Messung des Acetylphosphat-Verbrauchs beruht, anstatt eine Kopplung der TP-Produktion an die Reduktion eines ADP zu nutzen. Da dieser Test nicht auf der TP-Produktion beruht, kann er für eine neue Gruppe von Acetatkinasen verwendet werden, die Powerphosphat anstelle von TP produzieren. Für eine Standardkurve mit sechs bis acht Punkten verdünnen Sie die Acetylphosphat-Stammlösung in 100 Millimolar Triss auf ein Endvolumen von 300 Mikrolitern. Fügen Sie ebenfalls eine Kontrollprobe ohne Acetylphosphat hinzu und temperieren Sie alle Proben eine Minute lang in einem 37 °C warmen Wärmeprobeblock.

Fügen Sie nun 50 Mikroliter zweimolares Hydroxylamin-Hydrochlorid hinzu, mischen Sie durch dreimaliges Schütteln und inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem 60 Grad Celsius heißen Block. Danach geben Sie 100 Mikroliter Entwicklerlösung hinzu, mischen erneut durch dreimaliges Schütteln und lassen die Färbung mindestens eine Minute bei Raumtemperatur entstehen. Zentrifugieren Sie die Proben unter Verwendung von Kunststoffküvetten für das Spektrophotometer.

Messen Sie die Proben bei 540 Nanometern. Erstellen Sie mithilfe geeigneter Software für Datenanalyse und Diagrammerstellung eine Standardkurve der Extinktion bei 540 Nanometern in Abhängigkeit von der Menge an Acetylphosphat in Mikromol. Berechnen Sie den R-Quadrat-Wert.

Verteilen Sie 300 Mikroliter Aliquots der Reaktionsmischung auf Mikrozentrifugenröhrchen. Denken Sie daran, eine Kontrollreaktion ohne Enzym einzuschließen, und lassen Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 37 Grad Celsius äquilibrieren. Wenn mehrere Reaktionen durchgeführt werden, geben Sie das Enzym in die Röhrchen zu bestimmten Zeitintervallen hinzu und stellen Sie jedes Röhrchen unmittelbar danach wieder in den 37 Grad Celsius warmen Wärmehalter.

Nach fünf Minuten 50 µL zweimolaren Hydroxylamin-Hydrochlorid hinzufügen, mischen und fünf Minuten bei 60 °C inkubieren. Anschließend 100 µL der Entwicklerlösung hinzufügen, mischen und zur Farbentwicklung bei Raumtemperatur stehen lassen. Danach die Proben eine Minute bei 18.000 ×g zentrifugieren.

Messen Sie die Absorption bei 540 Nanometern. Bestimmen Sie die Menge an vorhandenem Acetylphosphat durch Vergleich mit der Standardkurve für Acetylphosphat. Die Daten können aufgetragen und mit der McKayla-Cementin-Gleichung gefittet werden, um die kinetischen Parameter zu bestimmen.

Dieser Test bestimmt den Verbrauch des Acetylphosphat-Substrats, um die Acetatkinase-Aktivität in Richtung der Acetatbildung zu messen. Nach einer bestimmten Reaktionszeit verbleibendes Acetylphosphat wird in Acetyl-Oxybat und anschließend in einen rot gefärbten ferrischen Hydroxybat-Komplex umgewandelt, dessen Extinktion bei 540 Nanometern gemessen werden kann. Diese typische Standardkurve, die die Extinktion bei 540 Nanometern gegen die Mikromol Acetylphosphat aufträgt, weist eine Steigung von 1,2332 Extinktionseinheiten pro Mikromol Acetylphosphat auf.

Der resultierende Bestimmtheitsmaßwert von 0,99 zeigt an, dass die Daten gut mit der hier dargestellten linearen Gleichung übereinstimmen. Dieser Assay kann verwendet werden, um den KM-Wert von Acetylphosphat für verschiedene Enzympräparationen zu bestimmen. Bei fünf Millimolar DP mit variierenden Konzentrationen von Acetylphosphat folgt die gereinigte rekombinante Acetatkinase aus Methanol Sarina thermophilic für jeden Substrat standardmäßigen McKayla-Cementin-artigen Kinetiken, was zu einem scheinbaren KM von 0,27 ± 0,01 Millimolar Acetylphosphat führt.

Im Gegensatz zum standardmäßigen gekoppelten Assay kann dieser direkte Assay die Aktivität von Acetat-Kinasen messen, die Substrate verwenden, die keine ATP sind. Beispielsweise wurde bei der Verwertung von Acetylphosphat durch die Pyrophosphat-bildende Acetat-Kinase aus Entamoeba histolytica Natriumphosphat im Reaktionsgemisch anstelle von ADP eingesetzt. Die sich ergebende Kurve zeigt einen scheinbaren KM-Wert von 0,50 ± 0,006 Millimolar Acetylphosphat an. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man die Aktivität der Acetat-Kinase direkt misst, indem man die Menge des verbrauchten Acetylphosphats bestimmt.

Ein entscheidender Faktor für die Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse ist die Konsistenz bei jedem Arbeitsschritt, insbesondere beim Hinzufügen des Enzyms und beim Mischen.