Intrazelluläre Rückfaltung Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die chaperonabhängige intrazelluläre Proteinfaltung nach Hitzeschock zu messen. Verwenden Sie einen Luciferase-Reporter, transfizieren Sie zunächst Zellen mit Plasmiden, die das Luciferase-Reportergen und den Chaperon von Interesse tragen. Anschließend teilen Sie die transfizierten Zellen gemäß dem experimentellen Design für die Erholungszeitpunkte auf.

Am nächsten Tag die Zellen einer Hitzeschockbehandlung unterziehen, um die Proteinentfaltung zu induzieren. Anschließend eine Regenerationsphase einlegen, um die intrazelluläre Proteinrefaltung wiederherzustellen, und danach die Aktivität des Luciferase-Reportergens messen. Die Ergebnisse quantifizieren die zeit- und chaperonabhängige Proteinrefaltung basierend auf dem Luciferase-Assay.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dem In-vitro-Faltungs-Assay, liegt in der Möglichkeit, einen physiologischeren Endpunkt der Wirkung von Verbindungen oder Proteinen auf die Chaperon-Aktivität zu erhalten. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie einer Vielzahl von Erkrankungen wie neurodegenerativen Krankheiten oder Krebs hinein, da Chaperone eine wichtige Rolle bei der Entstehung dieser Pathologien spielen. Erwärmen Sie zuerst das Kulturmedium, PBS und Trypsin in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius vor.

Spülen Sie eine konfluente Kultur von HEK 293-Zellen mit fünf Milliliter PBS. Geben Sie dann einen Milliliter Trypsin mit 0,025 % EDTA hinzu, drehen Sie die Platte vorsichtig, um das Trypsin gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie bei 37 °C. Schütteln Sie die Platte in regelmäßigen Abständen, um die Zellablösung zu überprüfen.

Suspendieren Sie die Zellen nun in 10 Milliliter vollständigem DMEM-Medium und überführen Sie sie in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Anschließend zählen Sie die Zellen mithilfe einer Beckman-Zählplatte. Die Zellen weisen eine Konfluenz von etwa 60 bis 70 % auf und werden für sechs bis acht Stunden inkubiert.

Äquilibrieren Sie das Extreme Gene Nine-Reagenz auf Raumtemperatur und die Portion serumfreies Medium auf 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie das serumfreie Medium in zwei Eppendorf-Röhrchen. Geben Sie dann das Extreme Gene Nine-Reagenz hinzu, ohne die Wand des Eppendorf-Röhrchens zu berühren, und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie derweil die 2D-NA-Transfektionsmischungen vor: Geben Sie in Röhrchen eins ran vanilla Firefly und einen leeren Vektor-Kontrollvektor, in Röhrchen zwei ran vanilla Firefly und den molekularen Chaperon. Geben Sie die DNA zur Transfektionsreagenz-Mischung, wirbeln Sie die Mischung und inkubieren Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Fügen Sie diese Mischung weiterhin zu den platzierten Zellen hinzu und inkubieren Sie sie für 24 Stunden. Gewinnen Sie die transfizierten Zellen mit Trypsin, säen Sie die Zellen bei 60 bis 70 % Konfluenz in Sechs-Well-Platten aus und lassen Sie sie über Nacht im Inkubator. Aspirieren Sie das Medium von den transfizierten Zellen ab.

Anschießend einen Milliliter Hitzeschockpuffer hinzufügen und 30 Minuten lang inkubieren. Um die De-novo-Proteinsynthese zu stoppen, die Deckel mit Paraform-Streifen verschließen und 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 45 Grad Celsius inkubieren. Nun den Paraform entfernen und die Zellen für die Erholung zu den festgelegten Zeitpunkten zurück in den Inkubator stellen.

Die Zellen gewinnen und einmal mit PBS waschen. Für eine effiziente Zelllyse das Zellpellet in flüssigem Stickstoff schockgefrieren, 200 Mikroliter verdünnter passiver Lysepuffer hinzufügen. Nun im Dreifachansatz aliquotieren: 30 Mikroliter der Zelllyse pro Vertiefung einer 96-Loch-Platte.

Um die Transfektionseffizienz zu bewerten, beginnen Sie mit den nicht geschädigten Referenzproben. Um die Ran-Luciferase-Aktivität zu messen, bereiten Sie frisch einen 0,2 Millimolar-Luciferin-Gly-Gly-Puffer-Reaktionspuffer vor, der 1 Millimolar ATP und 0,2 Mikromolar Ezin-Reaktionspuffer enthält. Setzen Sie die 96-Well-Platte in das Luminometer ein und starten Sie das Programm.

Wallach 1420-Arbeitsstation. Führen Sie die Pumpe eins in das Falcon-Röhrchen ein, das 0,2 Mikromolar Ezin-Reaktionspuffer enthält. Wählen Sie aus dem Menü die Option „Dosiergeräte-Wartung“ und aktivieren Sie Pumpe eins.

Wählen Sie die Option „Fill“ aus, um das Plattenlayout zu bearbeiten. Wählen Sie die Option „Explore Protocol and Results“ im Menü und anschließend das gewünschte Protokoll aus.

Wählen Sie nun die zu messenden Wells aus. Kehren Sie zum Wallach-Manager zurück und klicken Sie auf Start, um die Emissionen der Proben zu messen. Bei 482 Nanometern fahren Sie mit der Dosiererwartung fort und wählen Sie „Leeren“ und „Pumpe eins“, um die restliche Lösung zurück in das Röhrchen abzugeben.

Bringen Sie das Rohr nun in einen Falcon mit Wasser und markieren Sie es, spülen Sie es aus. Fahren Sie fort, indem Sie „Leer“ auswählen. Setzen Sie dann das Rohr der Pumpe eins in den Reaktionspuffer und das Rohr der Pumpe zwei in die LUCIFERIN-Lösung.

Ändern Sie das Plattenlayout. Wählen Sie Füllen für Pumpe eins und Pumpe zwei aus. Wählen Sie aus dem Dispenser-Wartungsmenü das Protokoll aus und beginnen Sie mit der Messung der Wellenlänge der Feuerfliegen-Luciferase-Reaktion bei 560 Nanometern.

Am Ende des Wiederholungsvorgangs das Verfahren erneut durchführen, leeren, spülen, erneut leeren. Für Pumpe eins und Pumpe zwei die Ergebnisse im Wallach 1420 Explorer anzeigen. Jedes Experiment ist einem Assay zugeordnet.

Anzahl Benutzername Anfangs- und Enddatum Ergebnisse als Excel-Datei exportieren. Für die Analyse ist die Proteinfaltungsreaktion direkt mit der Erholungszeit verknüpft. In diesem Experiment werden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Hitzeschockbehandlung ausgewertet.

Bei Abwesenheit und Anwesenheit eines molekularen Chaperons. Wie erwartet steigt der Prozentsatz an refoldeter Luciferase mit verlängerter Regenerationszeit sowohl in den Kontrollen als auch in Zellen, die mit dem molekularen Chaperon transfiziert wurden. Im Gegensatz dazu weist ein ungültiger Datensatz niedrige Bestimmtheitsmaße (R-Quadrat-Werte) für die Korrelation zwischen Zeit und Refolding auf.

Mithilfe dieser Technik können weitere Methoden wie das in-vitro-TPA-Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Hemmung der enzymatischen Aktivität des Chaperons. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie intrazelluläres Protein gemessen wird. Wir folgen nach Hitzeschock.