Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Nanoporen in künstlichen Membranen zur Verwendung in Proteinabsorptionsstudien herzustellen. Dies wird erreicht, indem mit einem STEM Nanoporen in eine Nitridmembran gebohrt werden. Anschließend wird die Nanopore in eine Kammer eingebracht und mit einer ionischen Lösung benetzt.

So bildet die Flüssigkeit eine Brücke von einer Seite des Nanopores zur anderen, um den Nanoporen für Experimente vorzubereiten. Es wird eine Spannung angelegt, und ein Strom von Ionen kann beobachtet werden, der durch ihn hindurchtritt. Der letzte Schritt besteht darin, Protein in die Nanoporenkammer hinzuzufügen.

Die letztendliche Beobachtung langlebiger Blockaden im Ionenstrom durch die Nanopore macht die Absorption von Proteinen an den Seiten der Nanopore sichtbar. Hallo, ich bin Dave Wicki. Ich bin Doktorand in der Abteilung für Physik an der Syracuse University.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Absorption von Proteinen an anorganischen Oberflächen ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen, Einzelmolekülspektroskopie und die Untersuchung von Molekülen in begrenzten Räumen. Beginnen Sie damit, den STEM auf eine Beschleunigungsspannung hochzufahren.

Laden Sie anschließend ein SPI-Siliziumnitrid-Window-Gitter in den TEM-Probenhalter. Reinigen Sie das Gitter mit Sauerstoffplasma für 30 Sekunden, um Rückstände zu entfernen. Bevor Sie die Probe laden, bringen Sie den Probenhalter in das TEM ein und lassen Sie das Vakuum abpumpen.

Im Hellfeld-TEM-Modus das Nitridfenster, ein helles Quadrat auf dem rohen Programm, finden. Sicherstellen, dass die TEM korrekt justiert ist. Anschließend die Probe justieren und fokussieren.

Schalten Sie nun das System in den STEM-Modus und verwenden Sie einen heißen Ablenkdetektor, um die Probe abzubilden und ihre Ausrichtung zu überprüfen. Stellen Sie den Monochromator, sofern vorhanden, auf einen niedrigen Wert ein, um einen höheren Elektronenstrom für das Bohren zur Verfügung zu stellen. Wählen Sie die geeignete Spotgröße zum Bohren des Nanopores basierend auf dem Durchmesser der Elektronensonde.

Bei ausgerichtetem Stamm. Verwenden Sie das BROGRAMM, um perfekt auf die Nitridmembran bei der erforderlichen Vergrößerung zu fokussieren. Falls sich die Probe bewegt, blenden Sie den Elektronenstrahl aus und warten Sie, bis sich die Probe stabilisiert hat.

Dies kann bis zu einer Stunde dauern. Sobald die Stabilisierung erfolgt ist, platzieren Sie die Elektronensonde auf der Probe und beginnen Sie mit dem Bohren des Nanopores. Das Bohren eines Nanopores mit einem TM erfordert geduldige Präzision.

Es handelt sich um einen Prozess, bei dem das Nitrid unter einem Elektronenstrahl allmählich abgebaut wird. Es ist wichtig, den Elektronenstrahl direkt über der Bohrstelle zu halten und zu überprüfen, ob das Nanopore vollständig gebohrt ist. Bevor die Probe aus dem TEM entfernt wird, sollte die Probe regelmäßig durch Abtasten mit dem heißen Aus-Detektor überprüft werden.

Wenn sich die Probe leicht verschiebt, justieren Sie die Position der Elektronensonde so, dass sie sich über dem Nanopore befindet. Wenn das ROI-Gramm scharf gestellt ist, verschwindet der schimmernde Nitridfilm. Wenn sich das Nanopore bildet, während das Roky-Gramm unscharf ist, ist der ausgefranste Rand sichtbar.

Bilden Sie das Nanopore mit ausgeschaltetem Heizelement ab und erstellen Sie ein Intensitätsprofil des Bildes. Der Durchmesser des Nanopores kann anhand des dunkelsten Bereichs des Profils geschätzt werden. Der Elektronenstrahl kann bei Bedarf verwendet werden, um das Nanopore zu vergrößern.

Wenn es den erforderlichen Durchmesser erreicht hat. Wechseln Sie in den TEM-Modus mit dem Monochromator in der Standardeinstellung. Verwenden Sie die Hellfeld-TEM, um die Porengröße zu bestätigen.

Beginnen Sie mit der Herstellung von entgastem Kochsalzlösung. Setzen Sie die Lösung unter Vakuum und behandeln Sie sie 20 Minuten lang vorsichtig mit Ultraschall im Wasserbad. Stellen Sie dann den empfindlichen Nanoporen-Chip mit Siliziumnitrid vorsichtig in einen 10-Milliliter-Pyrex-Becher. Anschließend stellen Sie den Becher in einem Abzug auf einen Heizblock.

Reinigen Sie den Nanopore-Chip äußerst sorgfältig mit Piranha-Lösung. Geben Sie zunächst mit einer Glaspipette drei Milliliter Schwefelsäure in das Gefäß. Fügen Sie danach vorsichtig ein Milliliter hochkonzentrierte Wasserstoffperoxidlösung zur Schwefelsäure hinzu.

Bitte beachten Sie alle Vorsichtsmaßnahmen. Lassen Sie den Nanoporen-Chip 10 Minuten lang einweichen. Entfernen Sie anschließend mithilfe einer Glaspipette die Piranha-Lösung aus dem Becher und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.

Füllen Sie anschließend das Becherglas mit entgastem, deionisiertem Wasser. Leeren Sie das Becherglas mit einer sauberen Glaspipette und wiederholen Sie diesen Spülvorgang mindestens fünfmal. Entfernen Sie den Nanoporen-Chip mit sauberen Pinzetten und trocknen Sie ihn durch leichtes Absaugen.

Nach dem Trocknen sofort den Nanoporen-Chip in die Kammer einsetzen und versiegeln. Der Chip kann in der Kammer mit O-Ringen oder Silikon-Dichtmasse befestigt werden. Füllen Sie die Kammer mit Kaliumchloridlösung.

Verbinden Sie die Silber-Silberchlorid-Elektroden mit der Kammer. Die Elektroden können hergestellt werden, indem man Silberdraht über Nacht in Bleichmittel einlegt. Legen Sie ein transmembranöses Potential über die Elektroden an und überwachen Sie die Stromantwort mithilfe eines Patch-Clamp-Verstärkers.

Erstellen Sie im Spannungs-Clamp-Modus aus den Messungen eine Strom-Spannungs-Kurve. Die Kurve sollte stark linear sein. Bei Verwendung von einmolarer Kaliumchloridlösung sollte die Leitfähigkeit der Nanopore ihrem Durchmesser entsprechen.

Wenn die Nanopore keine lineare Strom-Spannungs-Kurve zeigt, ist die Leitfähigkeit zu gering oder der Offenstrom der Nanopore ist nicht stabil. Dies deutet darauf hin, dass die Nanopore nicht ordnungsgemäß eingesetzt wurde, und die Piha-Reinigung sollte wiederholt werden. Es ist entscheidend sicherzustellen, dass sich Flüssigkeit innerhalb der Nanopore befindet.

Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, weist der Ionenstrom durch das Nanopore sehr starkes Rauschen auf und die Partitionierung von Proteinen in die Nanopore ist drastisch verringert. Beginnen Sie damit, eine gereinigte Probe des Proteins der gewünschten Interesse in das geerdete Bad der Kammer hinzuzufügen. Warten Sie, bis sich die Probe vollständig diffundiert hat.

Legen Sie eine transmembrane Potentialdifferenz mit einer Polarität an, die entgegengesetzt zur Gesamtladung des untersuchten Proteins ist. Eine angelegte Spannung von 200 Millivolt sollte ausreichend groß sein, um messbare Effekte zu beobachten. Die meisten Ereignisse bei proteinhaltigen Analyten erscheinen als vorübergehende Stromabweichungen von der Grundlinie.

Wenn kein Signal beobachtet wird, erhöhen Sie die Konzentration des Proteins in der Kammer. Höhere Spannungen verbessern das Signal-Rausch-Verhältnis und Nitrid. Nanoporen können mehrere Volt aushalten.

Proteinabsorptionen erscheinen als langanhaltende Änderungen des Basisstroms des Nanopores. Typische Ergebnisse für feste Nanoporen sind wie folgt: Der Öffnungsstrom sollte äußerst stabil sein.

Die Strom-Spannungs-Charakteristik des Nanopores sollte hochgradig linear sein. In einer Lösung aus einmolarigem Kaliumchlorid und zehnmolarischem Kaliumphosphat, pH 7,4, liefert die Steigung einer linearen Anpassung an die Strom-Spannungs-Kurve die Einzel-Leitfähigkeit des Nanopores. Die Leitfähigkeit steht in direktem Zusammenhang mit dem Nanopore-Durchmesser und sollte der Gleichung entsprechen.

Dieser Wert sollte innerhalb von 30 % übereinstimmen. Wenn der Wert zu gering ist, ist die Pore wahrscheinlich nicht mit dem Zusatz des Proteins verbunden. Schnelle Ereignisse sollten eintreten, sobald die Proteinabsorption einen lang anhaltenden Stromabfall verursacht. Einige Proteine sind stark labil und durchlaufen eine strukturelle Umwandlung im Inneren der Pore.

In diesem Fall wird der lang anhaltende Spannungsabfall von schnellen Schwankungen begleitet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Festkörper-Nanoporen unter Verwendung eines Raster-Transmissions-Elektronenmikroskops herstellt und wie man diese zur Absorption von SA-Proteinen nutzt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Piranha-Lösung äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug mit Handschuhen, einem Laborkittel und einer chemiebeständigen Schürze, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.