Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer Methode, die als Tandem-Affinitätsreinigung bekannt ist, an Proteine bindende Partner zu isolieren. Hallo, ich bin dLAN Bailey aus der Abteilung für Virologie am Imperial College London. In unserem Labor untersuchen wir die Wechselwirkungen zwischen Viren und ihren Wirten für verschiedene Mitglieder der Virusfamilie.

Die Identifizierung von Proteinen, die mit anderen zellulären oder viralen Proteinen interagieren, ist ein hervorragender Ausgangspunkt, um das Zusammenspiel zwischen dem Virus und seinem Wirt während einer Infektion zu untersuchen. In diesem Video erkläre ich einen Ansatz, den wir in unserem Labor verwenden: die Tandem-Affinitätsreinigung, auch TAP-Tagging genannt. Das in dieser Studie verwendete TAP-Tag ist ein N-terminales Tag, das aus zwei Einheiten Protein G und einem Strep-Avidin-Bindungspeptid besteht.

Sie sind durch eine TEV-Protease-Spaltsequenz getrennt, die eine spezifische Elution des Bait-Proteins ermöglicht. In diesem Beispiel befindet sich das murine EIF4E am C-Terminus dieses Fusionskonstrukts. Das TAP-Tagging-Protokoll ist ein sechsstufiges Verfahren.

Nach der Transfektion und Erzeugung von Zelllinien werden die Zellen zur Expression des Tag-abate-Proteins induziert, bevor sie in einem milden Lysepuffer lysiert werden. Zur Reinigung des Bait-Proteins und eventueller Interaktionspartner werden zwei Affinitätsreinigungsschritte und zwei spezifische Pufferlösungen verwendet, um Zelllinien zu erzeugen. HEC-2-93-Zellen sollten mit dem P-met-vier-Expressionsvektor transfiziert werden, der kodiert.

Die Zellen mit dem mit einem Tap-Tag markierten Bait-Protein werden dann mit hundert Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin B ausgewählt. Da das Plasmid episomal erhalten bleibt, ist es nicht notwendig, spezifische Klone zu isolieren. 10 konfluente Zellkulturen werden durch die Behandlung mit 10 Mikromolar Cadmiumchlorid für 16 Stunden induziert, bevor sie in Medium abgeschabt werden. Die suspendierten Zellen werden anschließend in 15-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert.

Diese Zellen werden dann dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen, bevor sie abschließend pelletiert werden. Im zweiten Schritt erfolgt die Zelllyse, bei der die Zellen durch mehrfaches Pipettieren in fünf Milliliter kaltem Lysepuffer lysiert werden und anschließend fünf Minuten auf Eis stehen gelassen werden. Um eine effiziente Lyse sicherzustellen, werden die Zellen danach mehrmals durch eine dünne, stumpfe Nadel gespritzt und einem Gefrier-Tau-Zyklus unterzogen.

Das resultierende Lysat wird auf 1,5-ml-Röhrchen verteilt, und Zellen sowie Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt. Bemerkenswert ist, dass die Größe des Pellets nach diesem Zentrifugationsschritt deutlich abnimmt. Die Überstände der Lysate werden anschließend in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen vereinigt und durch einen 0,45-Mikrometer-Filter filtriert, um eventuell verbliebene Partikel zu entfernen.

Es sollten 50 Mikroliter-Aliquote dieses Lysats für die anschließende Analyse entnommen werden. Diese Probe wird als Probe eins bezeichnet. Schritt drei: Bindung an Kaninchen-IgG-Aeros.

In diesem Stadium des Protokolls werden die Protein-G-Markierungen durch Kaninchen-IgG-Aros immunpräzipitiert. Um Aros-Perlen abzugeben, entfernen Sie die Spitze der Ape-Pipette. Dies trägt dazu bei, Beschädigungen der Perlen zu vermeiden.

Suspenderen Sie die Kaninchen-IgG-Aro-Lösung vorsichtig durch Schwenken der Flasche, bevor Sie die Aros in ein 15-ml-Röhrchen überführen. Waschen Sie die Aros dreimal mit gekühltem Lysepuffer unter Verwendung einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, um die Perlen in jedem Schritt zu klären. Die pelletierten Kaninchen-IgG-Perlen sollten nach der Zentrifugation sichtbar sein.

Nach jedem Schritt vorsichtig den Puffer entfernen, ohne die Kügelchen zu stören. Nach dem letzten Waschschritt das filtrierte und geklärte Lysat zu den gepackten Kügelchen geben und drei Stunden oder über Nacht inkubieren. Die Inkubation erfolgt bevorzugt bei vier Grad C mithilfe eines rotierenden Mixers.

Nach der Immunpräzipitation die Agarose-Beads abzentrifugieren und den Überstand für die nachfolgende Analyse entfernen. Falls erforderlich, kann eine feine Pipettenspitze verwendet werden, um jegliche restliche Flüssigkeit aus diesem Röhrchen zu entfernen. Dieser Überstand ist Probe zwei, Schritt vier, TEV-Protease-Spaltung.

In diesem Schritt wird der Köder von den Protein G-Tags abgespalten. Dieser Schritt ermöglicht die gezielte Spaltung des Köderproteins und stellt somit einen Elutionsschritt aus der mit Kaninchen-IgG beschichteten Aros-Immunpräzipitation dar. Bereiten Sie die TEV-Spaltmischung vor und geben Sie diese mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze zu den Aros-Kügelchen. Überführen Sie dieses Gemisch in ein silikonisiertes Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie es um, um die Aros vor der Übernachtkultivierung bei vier Grad C in Suspension zu bringen. Entnehmen Sie eine Aliquot aus dieser TEV-Spaltreaktion zur Analyse.

Dies ist Probe drei. Eine Übernacht-Inkubation im rotierenden Mischer sollte ermöglichen, dass die TEV-Reaktion nahezu vollständig abläuft. Schritt fünf, Bindung an immobilisierte Streptavidin-Kügelchen.

In diesem Schritt werden der Cleve-Bait und mögliche Bindungspartner aus der Lösung mittels Affinitätsreinigung gewonnen. Zentrifugieren Sie zunächst die TEV-Spaltungsreaktion, die die Kaninchen-IgG-Aros-Kügelchen enthält. Um das Aros-Pellet zu erhalten, entnehmen Sie eine Menge der geklärten Überstandflüssigkeit zur Analyse.

Dies ist Probe vier. Entfernen Sie sorgfältig das gesamte verbleibende Überstand, der Ihr Bait-Protein enthält, in ein frisches Röhrchen. Verwenden Sie erneut feine Pipettenspitzen.

Den Überstand mithilfe von Pipettenspitzen vollständig entfernen. Die Kaninchen-IgG-Aros-Perlen für die nachfolgende Analyse aufbewahren. Dies ist Probe fünf.

Um Schäden an den Strep-Adin-Beads zu vermeiden, entfernen Sie das Ende von einer Pet-Spitze. Resuspendieren Sie die Beads vorsichtig und entnehmen Sie eine Aliquotte in ein silanisiertes Röhrchen. Waschen Sie die Strep-haltigen Beads mit S-Puffer, wobei Sie durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit klären.

Nach jeder Waschung. Nach jeder Waschung vorsichtig den Puffer entfernen. Die Streptavidin-Kügelchen sind sehr klein und können leicht verschoben werden, selbst bei vorsichtiger Handhabung.

Bauen Sie die Pet-Spitzen auf. Nachdem die Streptavidin-Perlen gewaschen wurden, geben Sie das Überstand aus der TEV-Spaltungsreaktion zu diesen Perlen hinzu und inkubieren die Reaktion drei Stunden oder über Nacht bei vier Grad C unter Verwendung eines rotierenden Mischers.

Nach der Inkubation die Zentrifuge mit den Streptavidin-Perlen durchführen und das Überstand entfernen. Dies ist Probe sechs. Zu beachten.

Das Beit-Protein ist nun an die verbleibenden Kügelchen im Reagenzglas gebunden. Waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen, die Ihr Bait-Protein enthalten, mit Lysepuffer. Um eventuelle zusätzliche verunreinigende Proteine zu entfernen, ziehen Sie die restliche Waschlösung von den Kügelchen ab und lassen Sie diese auf Eis liegen.

Schritt sechs, Biotin-Elution. In diesem Schritt wird Biotin zu den Streptavidin-Kügelchen gegeben. Die Wechselwirkung zwischen Biotin und den Streptavidin-Kügelchen verdrängt den Köder, der wieder in Lösung geht.

Geben Sie die Biotin-Lösung direkt zu den Kügelchen und mischen Sie durch Vorsichtiges Invertieren. Inkubieren Sie die Reaktion bei vier Grad C für drei Stunden oder über Nacht unter Verwendung eines rotierenden Mischzentrifugen, die Biotin-Aeros-Mischung, und sammeln Sie die Mischung vorsichtig in einem frischen Gefäß. Dies ist Ihre endgültige EIT, bezeichnet als Probe sieben.

Die verbleibenden Streptavidin-Kügelchen sind Probe acht. Aufgrund ihrer niedrigen Proteinkonzentration muss dieses letzte Eluat vor der Analyse angereichert werden. Dies wird mithilfe von Spin-Säulen mit niedriger molekularer Grenzgröße erreicht, wobei das Volumen durch Zentrifugation verringert wird, wobei der Prozess regelmäßig überwacht wird.

Diese konzentrierte Probe kann aufgeteilt und mittels SDS-Page-Gelen durch Kumasi- und Silberfärbung analysiert werden. Falls die Proben mittels Massenspektrometrie analysiert werden sollen, empfehlen wir die Verwendung vorgefertigter kommerzieller Gele. Anschließend können einzelne Banden extrahiert und die Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert werden.

In diesem Fall war der Köder murin, EIF für das E-Protein. Der Vorteil des TAP-Systems besteht darin, dass Sie Ihr Protein von Interesse in einer bestimmten Zelllinie exprimieren können, und abhängig von der Zelllinie, die Sie untersuchen möchten, können Sie das Protein auch auf relativ niedrigem Niveau exprimieren. Sie entscheiden darüber, und alle posttranslationalen Modifikationen sowie die Lokalisation bleiben erhalten, sodass Sie häufig den nativen Komplex reinigen können.